細菌S-layer蛋白的研究新進展

細胞壁在原核生物的生命活動中起著重要的作用，而細胞壁最外層結構的多樣性反映了生物體對特定生態環境的適應。經過30多年的研究發現，古細菌及細菌的外表面有一個共同的結構即S-layer(Surface layer)，是由蛋白質成分的亞單元組成的一種單分子二維晶格結構，幾乎存在于所有有壁細菌及古細菌中[1]。形態學、化學及形態發生學研究表明，S-layer是進化中形成的一種最基本的生物膜結構[2]；S-layer 蛋白也是細胞內豐度最高的蛋白之一，可高達細菌總蛋白的15%左右[3]。S-layer 蛋白可以在體外自發組裝成重復多孔的晶格結構，這一特性使S-layer蛋白在離子選擇性結合基質、微載體、生物傳感器、疫苗、組織再生中的生物吸附系統等方面具有廣闊的應用前景。作者在此對近年來細菌S-layer蛋白的研究及應用進展進行了綜述。

1 S-layer 的起源、結構及化學特性

經過近半個世紀的研究，現已發現上百種主要的細菌類群都具有S-layer，包括藍藻和古細菌。據統計[4]，有200種真細菌及79種古細菌具有S-layer，這個數字還在不斷增加。

在不同的細菌中，S-layer結合的部位也不一樣。在革蘭氏陽性菌及古細菌中，S-layer亞單元與肽聚糖層或偽肽聚糖層連接；在革蘭氏陰性菌中，與細胞外膜的脂多糖層偶連；而在大多數缺少明顯細胞壁的古細菌中，S-layer是唯一的細胞壁組分，與細胞質膜緊密相連[4,5]。

S-layer大多是由單一的蛋白質或糖蛋白構成的二維晶格結構，表觀分子量介于40 000～200 000之間。因為它有最簡單的重復性分子結構，因而被認為是進化中形成的最基本的膜結構。

與真核生物的脂質雙層膜不同的是，S-layer蛋白只有一種蛋白組成，而且呈周期性排列。S-layer蛋白形成的亞單元在溶液中或者合適的界面上可以重新組裝成二維晶格結構，而界面的凈電荷、疏水性及特定的亞單元間的連接特性都會影響到S-layer亞單元組裝的方向和方式[5,6]。

2 S-layer蛋白的研究進展

近年來陸續對40多種S-layer蛋白基因進行了克隆和測序，發現S-layer蛋白有類似的結構組成。大多數S-layer蛋白由弱酸性的蛋白(或糖蛋白)組成，等電點介于3～6之間，少數幾種細菌如Methanothermusfervidus及幾種乳酸桿菌的S-layer蛋白的等電點分別是8.4和9～10。S-layer蛋白通常含有大量的谷氨酸和天冬氨酸(總摩爾分數約為15%)，不含或僅含少量的硫氨基酸。圓二色性檢測及氨基酸分析表明，40%的氨基酸殘基形成β-折疊，20%形成α-螺旋結構[7～9]。

許多古細菌和某些細菌還能糖基化S-layer蛋白，糖基部分是革蘭氏陰性菌的O-抗原多糖的主要組分。典型的糖鏈由20～50個含有中性己糖、戊糖、庚糖及氨基糖的相同重復元組成。革蘭氏陽性菌S-layer蛋白的糖鏈與革蘭氏陰性菌的脂多糖更相似，而不同于真核生物的碳鏈。S-layer糖蛋白的核心寡糖由2～4個糖基組成，大多通過O-糖苷鍵將碳鏈與蛋白部分連接。革蘭氏陽性菌的S-layer糖蛋白有2～4個糖基化位點，而古細菌中有高達25個糖基化位點，而且主要是N-糖苷鍵連接[10,11]。

為了與細胞的生長一致以覆蓋整個細胞，S-layer基因具有強啟動子。Boot等[12]的研究表明，L.acidophilus的S-layer基因啟動子效率是乳酸脫氫酶基因啟動子的2倍，而后者被認為是細菌中最強的啟動子之一。L.brovis的S-layer蛋白表達需要2個啟動子，其中一個離起始密碼子較近，在細胞生長的對數期及穩定期早期表達，另一個在細胞生長的其它時期表達。B.brevis的S-layer蛋白表達甚至需要3個啟動子。

大多數S-layer蛋白的分泌是通過信號肽途徑，但是Aeromonassalmonicida、C.fetus和C.crescentus則采用不同的分泌途徑[13]，如通過ABC(ATP-binding cassette)轉運體或I型轉運體。S-layer蛋白也存在一些翻譯后的修飾，包括氨基端或羧基端的切除、氨基酸殘基的磷酸化和糖基化等。

3 S-layer的功能

S-layer通常是復雜的細胞壁結構的一部分，因此功能上也不是獨立或單一的。目前對S-layer的功能了解并不多，很多方面還處于假說階段，缺乏足夠的實驗數據支持。

古細菌及細菌S-layer的功能主要有以下3點[14,15]：(1)作為保護衣、超濾分子篩、分子及離子陷阱；(2)作為細胞粘連和表面識別的基質；(3)在革蘭氏陰性的古細菌中作為決定細胞形狀的骨架。

由于S-layer也存在于人類和動物的多種病原體中，所以研究者對Aeromonassalmonicida、Aeromonashydrophila和C.fetus等[16]病原微生物的S-layer給予了特別的關注，這些研究將會闡明S-layer作為毒力因子方面的意義。

4 S-layer蛋白的應用

4.1 作為超濾膜

因為S-layer是由單個蛋白或糖蛋白組成的周期性排列結構，S-layer蛋白的每個分子單元都可以在亞納米水平表現出相同的生化特性，形成大小和形態相同的微孔，許多重要的功能基團(如羥基、氨基或羧基等)都以特定的位置和方向在微孔內排列，因而可通過化學修飾以獲得特定的S-layer超濾膜，這種超濾膜具有精確分子量并帶有不同電荷特性或親水性及疏水性。通過使用特定孔徑大小及生化表面特性的S-layer超濾膜，就可以確定超濾層的微孔大小與凈電荷的相關性、被吸附蛋白的分子特性(直徑、凈電荷等)及由于被吸附到超濾層表面所引起的流量損失等[17]。

4.2 作為固定功能分子的基質

鑒于S-layer蛋白晶格中每個分子的均勻性及其亞單元可以重新聚合的特性，可以使之成為特異性結合不同大小功能分子的理想載體。無論是在溶液中或是附著于支持物上，S-layer蛋白均可作為固定基質以可再生的方式結合單層的功能分子(如抗體、配體、半抗原、免疫原、酶等)。對于糖基化的S-layer蛋白，蛋白質部分及糖基殘基都可以用來固定不同的大分子。利用高分辨率的電子顯微鏡觀察到這些被固定的大分子可以反映S-layer晶格的重復方式。這一技術可用于生物分析傳感器、免疫測定及結合疫苗等方面[14,18]。

與通常所用的由無定形多聚體組成的有孔支持物相比，S-layer蛋白作為固定基質的優點是：在pH值7.0左右時，S-layer蛋白對大分子的非特異性吸附非常低，幾乎沒有背景反應；另外，單層酶、配體或抗體在S-layer表面上的有序排列可以避免一些自由擴散反應。在硅板上重新組裝的S-layer蛋白可以用深度超紫外放射定型，作為控制生物礦化的基質；表面被金屬氧化的S-layer蛋白可以用作納米材料制成的半引導器表面的模具，用以開發新的光電材料和設備。

4.3 作為功能脂膜的支持物

如何獲得在宏觀水平上具有特定功能特性的再生生物膜，無論對于基礎研究者還是應用研究者都極富吸引力。但是有功能的脂膜都是動態的流動結構，生命期短且穩定性差，從而妨礙了它們的結構功能和應用潛力的長周期研究。無支持物的脂膜瓦解的主要原因在于脂分子的橫向擺動性。在極端環境條件下(如低pH值、高鹽、高溫)生存的古細菌，其細胞壁由S-layer及相連的細胞質膜組成，因此，可以利用S-layer晶格結構來穩定大量再生的功能脂膜。通過將分離的S-layer亞單元注入Langmuir-Blodgett (LB)脂膜的面下相，就可在氣-水界面上獲得排列在脂膜上的、大量連貫的單分子S-layer晶格結構[19]。這些S-layer支持的LB脂膜可以覆蓋許多微孔，孔徑可達幾個微米，并且在后續的處理中依然保持結構的完整性。這項技術可以用在多個領域，如診斷學、傳感器技術、電子或光學設備等。

4.4 融合基因的表面展示

S-layer蛋白的一些結構域允許外源抗原決定簇的插入而不影響其組裝成規則的晶格結構，如利用幾種乳酸菌的S-layer可將幾種具生物活性的抗原決定簇進行表面展示。將SLP SbsA與nontypeableHaemophilusinfluenzae(NTHi)的抗原——其外膜蛋白Omp26融合，在老鼠中可產生Omp26特異性的抗體[20]。

Bohle等[21]將白樺花粉的主要過敏原Bet v 1與B.stearothermophilusATCC 12980的S-layer蛋白SbsC的C-端相融合產生的融合蛋白不僅具備有功能的過敏原，還能自組裝成單分子的晶格結構，將該融合蛋白作為疫苗可以安全高效地用于預防I型過敏癥。Avall等[22]將Lactobacillus的S-layer蛋白的每一段親水性結構域都成功地與6個組氨酸的多肽融合表達，并使宿主菌細胞表面產生結合Ni2+和Cd2+的能力。

Pleschberger將BacillussphaericusCCM 2177的SLP與前列腺特異性抗體重鏈的一個易變結構域序列相融合，所產生的融合蛋白在包被有烴硫基化的次級細胞壁多聚物的芯片上重新聚合結晶。這種高密度、具有特定配基間距的感受層可以用作表面胞質基因諧振生物芯片，以特異性地檢測前列腺特異性抗體。

蛋白A的B結構域可以結合IgG的Fc部分，將2個拷貝的人工合成的B結構域的類似物Z-結構域與來自BacillussphaericusCCM 2177的SLP SbpA融合，產生的融合蛋白不但可以再結晶，對IgG的吸附能力也比商用的免疫吸附劑高20倍。SbpA與增強的綠色熒光蛋白融合也可同時保持兩種蛋白的特性，而被這種融合蛋白包被的脂質體經過2 h的孵育還可以進入HeLa細胞[23]。

5 結語

在過去的10年中，對S-layer的研究取得了巨大的進展，20世紀70年代早期，全世界只有不到5個實驗室在關注S-layer，現在已有上百位研究者在300多種原核生物中發現了S-layer。通過對S-layer的合成、轉運、組裝、定位和功能進行深入的研究，發現這種在亞納米水平上形成的具有相同理化性質的單分子多孔蛋白晶體在納米技術上具有廣闊的應用前景，而可與外源多肽融合表達并在細胞表面展示為有功能的融合蛋白的特性更為納米生物技術開辟了新的領域。S-layer蛋白能在硅板上重新組裝成連續的單層結構，并可以用深度超紫外激光放射固定，利用這一特點可將其用作有功能表面、已固定的仿生膜和可控制的生物礦化中的基質。隨著研究的深入，S-layer蛋白的應用會越來越多。

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