生物制氫技術的發展及應用前景

任南琪，郭婉茜，劉冰峰

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，哈爾濱150090，rnq@hit.edu.cn)

目前，化石能源短缺，石油價格日益攀升，亟需尋求可再生、高效、清潔能源來替代.氫氣作為清潔能源的首選，是未來理想的燃料之一.在不同的制氫方法中，生物制氫技術作為一種低成本、低能耗的綠色能源生產技術，可以結合有機廢水處理和清潔能源生產而備受關注.

本文對生物制氫技術的發展及現狀進行了分析，指出目前生物制氫領域存在的主要問題，并對生物制氫的前景進行了展望.研究結果對于促進生物制氫技術的發展和加快生物制氫技術的產業化步伐具有重要的意義.

微生物制氫過程可以分為:(1)暗發酵制氫; (2)光生物制氫(光解水制氫和光發酵制氫); (3)光暗發酵耦合制氫.光解水和光發酵生物制氫是依賴光能供應的過程，暗發酵生物制氫是不需要光能的過程.這幾種制氫過程主要涉及3種微生物類群:暗發酵細菌，光解微生物(綠藻和藍細菌)和光發酵細菌.

1 暗發酵生物制氫技術

暗發酵生物制氫是利用厭氧發酵產氫細菌在厭氧條件下將有機物分解轉化為氫氣，此過程不需要光能供應.能夠進行暗發酵產氫的微生物種類繁多，包括一些專性厭氧細菌、兼性厭氧細菌及少量好氧細菌［1］，例如梭菌屬(Clostridium)、類芽孢菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等.

目前，已知的暗發酵產氫過程主要包括甲酸分解產氫、丙酮酸脫羧產氫以及NADH/NAD平衡調節產氫3種途徑.以葡萄糖為例，其暗發酵產氫過程為:首先，葡萄糖經糖酵解途徑生成丙酮酸、ATP和NADH;然后，丙酮酸被丙酮酸鐵氧化還原蛋白酶氧化成乙酰輔酶A、CO2和還原性鐵氧化還原蛋白(丙酮酸脫羧過程);或者經丙酮酸甲酸裂解酶而分解成乙酰輔酶A和甲酸，生成的甲酸再次被氧化為二氧化碳，并使鐵氧化還原蛋白還原(甲酸裂解過程);最后，還原性鐵氧化還原蛋白在氫化酶和質子的作用下生成氫氣.在產氫代謝過程中，不同的生態環境和不同的生物類群導致代謝的末端產物也不盡相同.根據末端代謝產物的不同，可以產生不同的發酵類型.傳統的暗發酵生物制氫可以分為丁酸型發酵和丙酸型發酵［2］.1990年以來，任南琪等通過對糖蜜廢水的連續流制氫研究，發現并提出了新的乙醇型發酵產氫途徑［3－5］.研究表明，當末端產物為乙醇時，氫氣產量較高［6］.特別指出的是E.harbinense sp. B49［7］、E.harbinense sp.Y3［8］及E.harbinense sp. lyf3［9］等高效產氫發酵細菌從CSTR反應器的活性污泥中成功地陸續分離，進一步證實末端產物以乙醇和乙酸為主的代謝類型可以得到較高的氫產率和產量.乙醇和乙酸的耦聯反應可保持NAD +/NADH的平衡關系，從而使乙醇型發酵得以有序地進行并具有較強的穩定性.

1.1 高效產氫新菌種的選育

為了尋求高效產氫微生物，獲得較高的產氫能力，國內外研究者們分離純化了大量新菌種，主要是兼性的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、專性厭氧的梭菌科(Clostridiaceae)以及一些高溫菌屬(Thermoanaerobacterium)等.

Kumar等［10］分離得到的陰溝腸桿菌E.cloacae IIT－BT08，靜態培養時其最大產氫能力為每摩爾己糖2.7 mol.之后又報道了產氣腸桿菌E.aerogens DM11靜態培養時的最大產氫能力可達每摩爾己糖2.80 mol［11］.我國研究者在高效產氫暗發酵細菌的選育工作中也取得一定的成績.林明［12］從正在運行的生物制氫反應器的厭氧活性污泥中分離出產氫細菌B49，其代謝類型為乙醇型，干細胞產氫能力為25～28 mmol/(g·h).任南琪等［8－9］陸續又從CSTR反應器中分離出高效乙醇型產氫細菌Ethanoligenens harbinense sp.R3和Ethanoligenens harbinense sp.Y3，在以葡萄糖為底物時，它們的最大產氫能力分別為干細胞產氫35.74 mmol/(g·h)和每摩爾葡萄糖產氫2.81 mol，產氫能力在國際上現有的高效野生產氫菌株中居于前列.該課題組還從溫泉中分離出一株能有效利用木糖發酵產氫的高溫菌T.thermosaccharolyticum W16，每摩爾木糖產氫2.19 mol，最大產氫速率為10.7 mmol/(L.h)［13］.

1.2 暗發酵生物制氫工藝形式

為了滿足高有機負荷和高生物量的要求，研究人員對多種新的工藝進行了研究.Alzate－Gaviria等［14］研究發現，利用UASB反應器處理城市垃圾和人工混合污水制氫，在pH=5.7±0.2、水力停留時間24 h的條件下，干細胞產氫量可達127 mL/(g·d); Chang等［15］采用有效容積為300 mL的固定床反應器，以蔗糖為底物，研究了水力停留時間在0.5～ 5.0 h，不同填料對生物產氫的影響.結果表明:以膨脹土為填料，水力停留時間為2 h時，最大氫氣產率為0.42 L/(L·h);以活性炭為填料，水力停留時間為1 h時，最大氫氣產率為1.32 L/(L·h). Lin等［16］利用硅膠樹脂做載體，以蔗糖為底物，在流化床中進行生物制氫研究，發現在一定范圍內，蔗糖濃度的升高和水力停留時間的降低都有利于產氫的增加.在蔗糖質量濃度為40 g/L，水力停留時間為2.2 h時，每摩爾蔗糖最大氫氣產量為(4.98±0.18)mol.Wu等［17］報道了在膨脹床反應器運行中，當水力停留時間為2 h時，臨界流速為0.85 cm/s，獲得的最大產氫速率為每m3反應器0.93 m3/h，每摩爾蔗糖最大氫氣產量可達2.67 mol.

我國暗發酵生物制氫技術發展較快，任南琪教授領導的課題組對碳水化合物(含糖廢水)為底物以自絮凝的厭氧活性污泥為氫氣生產者的發酵產氫進行了近20年的研究，研制出了CSTR型和EGSB型兩種高效生物制氫反應器，并于1999年完成了世界上首例中試研究，每立方米反應器每天穩定產氫5.7 m3.2005年，又完成了世界上首例“廢水發酵生物制氫示范工程”，采用的生物制氫裝置(CSTR型)有效容積65 m3，日產氫能力350 m3，成功完成了與氫燃電池耦合發電的工程示范，日產氫量可用滿足60～80戶使用.

1.3 暗發酵生物制氫工藝運行與調控

影響生物制氫反應器工藝運行的因素很多，如溫度、pH、原料(底物)和水力停留時間等等.

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一.大部分產氫微生物屬于嗜溫菌，厭氧菌的最適生長溫度在嗜溫菌生長溫度范圍的上限，但不同發酵產氫微生物的產氫溫度也存在較大的差異.Kumar等［18］證明 Enterobacter cloacae IITBT08在36℃時具有最大的產氫速率.Jung等［19］對Citrobacter sp.Y19的研究表明，其最適的細胞生長和產氫溫度為30～40℃.從節能的角度考慮，有研究者進行了常溫發酵產氫的研究，如Lin等［20］采用厭氧恒化器，在溫度15～34℃范圍內進行了活性污泥的產氫研究，與(35±1)℃條件下的產氫過程相比，常溫條件下(15～25℃)反應器的氫氣產量和氫氣體積分數均遠低于后者，因此尚未看出常溫發酵制氫的優勢.也有少數報道控制最佳產氫溫度為高溫范圍，如55℃時，可以達到較好的產氫效能［21］.

pH值對發酵產氫的影響往往與細胞內NADH/NAD動態平衡和產氫菌的生理條件有關. pH值會影響產氫微生物細胞內氫化酶活性和(或)代謝途徑，另外還會影響細胞的氧化還原電位、基質可利用性、代謝產物及其形態等.多數文獻報道［22－25］，嚴格的丁酸梭菌產氫最佳 pH是6.0～6.5;而產氣腸桿菌的產氫最佳pH在5.5～6.0［26］.Monot等［27］研究了細胞內pH值對發酵產物的影響，結果表明，高pH值條件下的發酵產物以酸類物質為主，低pH值條件下的發酵產物往往是丙酮和丁醇等物質.利用混合細菌發酵產氫的最佳pH范圍的報道分歧較大.大部分研究表明［28－33］，厭氧發酵產氫細菌產氫的最佳pH范圍在5.5左右.而任南琪等報道的乙醇型發酵最佳產氫pH 4.2～4.5［34］.

發酵法生物制氫過程的可持續性取決于產氫原料(底物)，而整個工藝的效率取決于底物的物理化學性質.目前的理論研究通常使用純底物(主要是葡萄糖、蔗糖、淀粉和纖維素)，而生產性應用則需要更為復雜的底物.研究發現，糖蜜廢水較適于暗發酵產氫［35］，淀粉產氫也具有較好的應用前景［36］.也有少數報道以有機廢棄物［37－40］，如豆腐渣、生活垃圾作為厭氧發酵產氫的底物，這類產氫試驗還僅限于小批量的間歇試驗階段，另有報道［41－42］以結晶纖維和麥稈作為發酵產氫底物，這些研究為降低生物制氫成本做出了極大的貢獻.

對于連續流運行的發酵產氫反應器，水力停留時間是重要的調控因子.從目前的研究看，厭氧反應器控制的水力停留時間通常為2～24 h，并且水力停留時間的差異與反應器結構形式的差異密切相關.文獻［43］指出:應用連續流攪拌槽式反應器(CSTR)，最佳產氫的水力停留時間通常控制在2～12 h;序批式厭氧反應器［44］最佳產氫的水力停留時間通常控制在4～12 h;填充式反應器［45－46］最佳產氫的水力停留時間通常控制在2～6 h;添加載體的豎向流反應器最佳水力停留時間很短，為0.5～2.0 h［47］.EGSB反應器在連續流生物制氫中顯示出很多優勢，在反應器停留時間為1.5～2.0 h時，每摩爾葡萄糖可產氫3.47 mol［35］.

2 光生物制氫技術

2.1 光解水生物制氫技術

光解水生物制氫主要是指綠藻和藍細菌，在厭氧光照條件下，利用自身特有的產氫酶系，將水裂解為氫氣和氧氣的過程，此過程沒有CO2的產生.其產氫機理和綠色植物光合作用機理相類似，但放氫機制卻截然不同.這兩種微生物生長的營養需求較低，只需空氣(CO2和N2分別作為碳源和氮源)、水(電子和質子)、簡單的無機鹽和光，能直接光解水產生氫氣，將太陽能轉化為氫能.綠藻在光照和厭氧條件下的產氫則由氫酶催化，而藍細菌的產氫則由固氮酶和氫酶的共同催化下完成.兩種生物所需的電子和質子均來自于水的裂解.

（1）實際進行建筑電氣安裝工程施工時，需要對電氣系統的絕緣電阻進行測試，并對絕緣電阻測試結果進行記錄，然后同時也需要對電氣設備調試的結果進行記錄。對于電氣設備的高度與開關開啟方向、配線等，都需要與圖紙要求保持一致，此外，室內電控箱、電表箱、插座盒、接線盒線頭拼接都需要安裝在一致范圍內，以使得安裝線路能夠保持一定的合理性。各個回路線、地線、零線、相線的顏色需要明確標準，并對管線敷設、設備、管線與開關的安裝時間進行合理確定，以科學性的進行相關安裝。

綠藻和藍細菌含有2個位于類囊體膜上的光合系統PS I和PS II，PS I的作用主要是生成還原劑用來還原CO2，PS II的功能是水的裂解和氧的釋放.綠藻類囊體膜上的捕光色素吸收光能后被迅速傳遞到PS II(P680)的反應中心，然后將水分解為H+和O2，并釋放電子.氧氣透過葉綠體膜進入線粒體，被線粒體呼吸作用消耗，同時固定CO2.質子被ATP合成酶泵到基質，以確保膜內外的質子梯度.電子按氧化還原電位依次升高的順序，經過類囊體膜上的質體醌、細胞色素等一系列電子傳遞鏈，傳遞至光系統PS I(P700)，在光照條件下進行能級躍遷，傳遞給鐵氧還蛋白(Fd)，最終傳給Fe－Fe氫酶的活性中心(HC)［48］.在氫酶的催化下，基質中的質子和從膜上傳來的電子結合生成氫氣，產氫過程僅僅維持幾秒至幾分鐘［49－50］.氧分子的存在，對氫酶活性產生強烈抑制，氧分壓達到2%時，氫化酶將失去活力，影響到產氫速率和產氫效率［51］.其原因是氧接近［Fe］－氫化酶或［NiFe］－氫化酶的催化位點，致使氫不能與H2－channel結合，導致氫化酶失活［52］.許多研究者致力于通過不同方法來增加氫酶對氧氣的耐受能力，來延長產氫時間，提高氫氣產量.

2000年，美國Melis等通過“剝奪”萊因綠藻(Chlamydomonas reinhardtil)培養物中的硫來使該藻類的CO2固定、放氧過程和碳消耗、產氫過程相分離，從而細胞在光照條件下通過光呼吸消耗氧氣，形成厭氧環境以使氫酶產氫順利進行，以間接避免氧氣對產氫的抑制，但是改造后的綠藻產氫量只達到理論產氫量的15%［53］.根據這種研究思想，兩步法制氫工藝被成功的應用，每升萊茵衣藻產氫速率可達到約3 mL/h，產氫時間長達70 h［54－55］.Seribert等［56］人根據氫酶的可逆催化特性，通過化學誘變成功篩選到2株耐氧性高出野生藻株10倍左右的誘變藻株，克服了H2和O2生成的不可兼容性，避免氧氣對氫酶的抑制，是綠藻產氫領域的重大突破.然而，在實際產業化和商業化應用中仍面臨許多技術問題.研究表明:光照條件下，氫酶所需的還原力除水外，內源性有機物質如淀粉等也可作為產氫的還原力，綠藻白天進行光合作用積累的有機物在黑暗條件下也可通過氫酶發酵產氫，但產氫效率較低［57］.

而藍細菌產氫則是在固氮酶和氫酶的共同催化下進行的，其中固氮酶催化產氫，氫酶吸收產生的氫氣.有異形胞的藍細菌主要通過固氮產氫［58］，可分為營養細胞和異形胞兩種.營養細胞含光系統I(PS I)和光系統II(PS II)，可進行CO2的還原和H2O的光解，釋放O2并產生還原性物質.產生的還原性物質可通過厚壁孔道運輸到異形胞，用于異形胞的固氮和產氫.在缺氮條件下，藍藻絲狀體由普通細胞經過細胞壁加厚形成一種特化細胞即異形胞.O2被加厚的細胞壁有效地阻止進入，為異形胞提供了局部低氧或厭氧環境，利于產氫.正常的營養細胞在厭氧條件下生長時，異形胞內的固氮酶系統可產生固氮酶并固氮.異形胞沒有PS II，只含PS I，所以不能進行水的光解放氧和CO2的固定，使異形胞維持在無氧或缺氧的環境.異形胞的光合磷酸化為固氮酶提供能量，確保固氮產氫過程的順利進行［59］.一種絲狀好氧固氮藍藻如魚腥藻，其細胞具有異形胞和營養細胞2種類型［60］.大多數藻類都是通過固氮催化釋放氫氣，在異形胞與營養細胞的共同作用下，光解水釋放H2和O2，即固氮放氫的過程.無異形胞單細胞藍藻的產氫主要由固氮酶催化，大部分無異形胞的藍藻由于沒有異形胞而失去了對氧氣的防護能力，只能在光暗交替情況下釋放H2［61］.

2.2 光發酵生物制氫技術

光發酵生物制氫是在厭氧光照條件下，光發酵細菌利用小分子有機物、還原態無機硫化物或氫氣做供氫體，光驅動產氫，產氫過程沒有氧氣的釋放.光發酵細菌只含有光合系統PS I，不含有PS II，所以同綠藻和藍細菌相比，在產氫的同時不產生氧氣，不存在氧氣對產氫酶的抑制，產氫純度和產氫效率高，可以簡化工藝過程.光發酵生物制氫是與光合磷酸化相偶聯的，由固氮酶催化的放氫過程.同時由于所需ATP來自光合磷酸化，所以固氮放氫所需要的能量來源不受限制，這也是光發酵細菌產氫效率高于暗發酵細菌的主要原因.

無論在間歇還是連續培養產氫過程中，菌種都扮演著重要的角色，其性能的優良直接影響到生物制氫技術的成敗.因此，獲取高效產氫的光發酵細菌一直是研究者關注的焦點.

Willison通過化學誘變的方法，篩選到Rhodopseudomonas capsulata B10菌株的膜結合氫酶缺陷株，生長迅速，該變異株在DL－蘋果酸、L－蘋果酸和D－蘋果酸中的產氫量比野生型菌株提高 10% ～70%［62］.Kim［63］研究了 Rhodobacter sphaeroides KD131的吸氫酶Phb－/Hup－突變株，產氫量明顯提高，為野生型的1倍左右.Tao［64］從廢水池塘中分離獲得一株光發酵細菌ZX－5，具有較強的產氫能力，在以琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鈉和丁酸鈉為碳源時，細胞生長都很好，底物轉化效率分別為81.4%、78.9%、69.0%和74.6%，最大氫氣產率分別是94、92、90和110 mL/(L·h).任南琪等［65］從淡水池塘底泥中分離獲得光發酵細菌Rhodopseudomonas faecalis RLD－53，該光發酵細菌具有較強的轉化乙酸為氫氣的能力，每mol乙酸鹽氫氣產量可達2.64～2.84 mol.鄭耀通等［66］在魚塘內分離到一株生長快的耐氨光發酵細菌Rhodobacter sphaeroides G2B，并結合處理有機廢水進行產氫研究［67］.

目前，除采用傳統選擇培養和遺傳誘變技術之外，遺傳工程技術改造產氫菌株和構建多功能基因工程菌是未來發展的方向.通過誘變或敲除吸氫酶基因，消除菌株的吸氫現象，采用基因重組等手段構建基因工程菌也是一種可行性比較強的提高產氫能力的方法.Kim等［68］通過基因重組R.rubrum(pRKhydA和pRKhydC)Fe－氫酶基因，在丙酮酸鹽存在的情況下，氫氣產量增加了約3倍，也說明了Fe－氫酶對丙酮酸具有明顯的依賴性.Kars等［69］通過缺失突變重組獲得了 R. sphaeroides O.U.001的 hupSL缺失突變株，在15 mmol/L蘋果酸鹽和30 mmol/L乙酸鈉的培養基中每升培養基分別產氫2.42 L和0.25 L，較野生型(1.97 l L和0.210 L)明顯提高約20%.

國內外研究者相繼展開了各種生活廢水、工業廢水、農副產品廢棄物等作為產氫底物的研究，以降低光發酵產氫的成本.

上述研究表明，使用光發酵細菌對廢水進行處理的同時，既得到清潔能源氫氣、降低制氫成本，又實現了廢棄物的資源化.

3 暗－光發酵耦合生物制氫技術

利用厭氧暗發酵產氫細菌和光發酵產氫細菌的優勢和互補協同作用，將二者聯合起來組成的產氫系統稱為光－暗發酵耦合生物制氫技術，包括暗－光發酵細菌兩步法和混合培養產氫2種方法.

3.1 暗－光發酵細菌混合培養生物制氫

暗發酵細菌能夠將大分子有機物分解成小分子有機酸和醇，以獲得維持自身生長所需的能量和還原力，解除電子積累而快速釋放部分氫氣.由于產生的有機酸不能被暗發酵細菌繼續分解而大量積累，導致暗發酵細菌產氫效率低下，成為暗發酵細菌產氫大規模應用面臨的瓶頸問題［74］.而光發酵細菌能夠利用暗發酵產生的小分子有機酸，消除有機酸對暗發酵制氫的抑制作用，進一步釋放氫氣.同時光發酵細菌不能直接利用纖維素和淀粉等大分子的復雜有機物，對廉價的廢棄的有機資源的直接利用能力和產氫能力較差.所以，充分結合暗－光發酵兩種細菌各自的優勢，將二者耦合到一起形成一個高效產氫體系，不僅可以減少光能需求，而且可以提高體系的產氫效率，同時還可擴大底物的利用范圍.

目前，光發酵生物制氫技術的研究程度和規模還基本處于試驗室水平，暗發酵生物制氫技術已完成中試研究［75］，要實現工業化生產仍需進一步提高轉化效率，降低制氫成本.純菌種生物制氫規模化面臨諸多困難，而且自然界的物質和能量循環過程，特別是有機廢水、廢棄物和生物質的降解過程，通常由2種或多種微生物協同作用.因此，利用微生物進行混合培養或混合發酵產氫己越來越受到重視.

暗－光發酵細菌混合培養是將不同營養類型和性能的微生物菌株共存在一個系統中，構建高效混合培養產氫體系，利用這些細菌的互補功能特性，提高氫氣生產能力及底物轉化范圍和轉化效率.

Miyake等［76］驗證了混合產氫途徑的可行性，暗發酵細菌 Clostridium butyricum和光發酵細菌Rhodobacter sphaeroides RV聯合氫氣產量高達每摩爾葡萄糖7 mol，而且降低了光發酵細菌產氫所需的能量.Yokoi等［77］報道了C.butyricum和Rhodobacter sp.M－19混合培養利用淀粉最大產氫量達到每摩爾葡萄糖6.6 mol，比單一厭氧菌利用淀粉的產氫量高4倍.鄭耀通和閔航［78］認為共固定光－暗兩種發酵細菌的混合培養方式是處理高濃度有機廢水持續產氫的最佳工藝模式.Asada等［79］采用乳酸菌Lactobacillus delbrueckii NBRC13953和Rhodobacter sphaeroides RV共固定在瓊脂凝膠中產氫，每摩爾葡萄糖最大氫氣產量為7.1 mol.丁杰等［80］利用固定化光發酵細菌Rhodopseudomonas faecalis RLD－53和游離的C.butyricum進行混合培養產氫，并對產氫過程中的一些關鍵性因素進行分析研究，實現了一個較高的氫氣產量，每摩爾葡萄糖產氫4.13 mol.Fang等［81］人研究了Clostridium butyricum和Rhodobacter sphaeroides以細胞數量比1∶5.9的比例混合培養，每毫升培養基氫氣產量最大為0.6 mL，同時應用FISH技術對混合培養產氫體系中2種菌進行了相對定量，認為該技術對于細菌在混合系統中的定量是有效的方法.然而，由于混合培養的2種類型的細菌在生長速率、種間差異等上存在著很大差別，實現其啟動和運行是很難實現的.

3.2 暗光發酵兩步法生物制氫

相對于混合培養產氫，兩步法產氫更容易實現，2種菌在各自的環境中發揮作用.第一步是暗發酵細菌發酵產生氫氣，同時產生大量的可溶性小分子有機代謝物，第二步是光發酵細菌依賴光能進一步的利用這些小分子代謝物，釋放氫氣.

Nath等［82］嘗試使用 Rhodobacter sphaeroides O.U.001來光發酵Enterobacter cloacae DM11的代謝產物，整個過程的氫氣量比單一過程的高.Tao等［83］證實了通過暗－光發酵細菌兩步法試驗，利用蔗糖作為底物，能夠顯著增加氫氣產量，每摩爾蔗糖氫氣產量最大達6.63 mol.Liu等［84］通過使用游離的乙醇型發酵細菌B49和固定化光發酵細菌R.faecalis RLD－53兩步法利用葡萄糖進行產氫，每摩爾葡萄糖產氫量達6.32 mol.Chen等［85］通過使用暗發酵細菌Clostridium pasteurianum CH4利用蔗糖作為底物時每摩爾蔗糖可以產生氫氣3.8 mol，通過Rhodopseudomonas palustris WP3－5對上述發酵液進一步處理，每摩爾蔗糖產氫10.02 mol，同時COD去除率達到72%.當使用光纖反應器進行光發酵試驗時，2個過程氫氣產量進一步增加到每摩爾蔗糖產氫14.2 mol，COD去除率幾乎接近90%，顯示了很好的氫氣生產能力和COD處理效果.Lo等［86］對難降解大分子物質淀粉進行酶解處理后，經過暗－光發酵2個過程即三步法氫氣生產過程，使COD去除率達到54.3%，每摩爾葡萄糖產氫3.09 mol，這一試驗結果說明:暗－光發酵的兩步法氫氣生產過程可以結合一定的預處理方法實現難降解大分子有機物的產氫，降低產氫原料成本，增加底物轉化效率，為實現生物制氫的商業化生產奠定基礎.然而，兩步法產氫過程中，需要2個反應器，增加了占地面積和處理步驟，而且光發酵過程的氫氣生產速率和細菌生長速率同暗發酵相比較低，是規模化生產的限制因素.

4 存在問題

生物制氫技術雖然發展較快，然而，該技術存在的一些主要問題限制了其產業化的步伐.

1)暗發酵生物制氫雖然具有產氫穩定、速率快等優點，但是，由于揮發酸的積累而產生反饋抑制作用限制了其產氫量.同時其生產和儲運設施不夠完善，嚴重制約其大規模應用.

2)光生物產氫技術，光能轉化效率低下問題一直困擾著廣大研究者.運用基因工程手段改造光發酵細菌的光合系統或人工誘變獲取高光能轉化效率的光發酵產氫菌株，深入研究光能轉化機制包括光能吸收、轉化和利用方面的機理，提高光能的利用率，以加快生物產氫的工業化進程.

3)成本問題制約了生物制氫技術的工業化應用.廉價底物的開發利用對降低生物制氫的成本至關重要.重點開展以工農業廢水、城市污水、畜禽廢水等可再生資源以及秸稈等含纖維素類生物質為原料進行暗發酵和光發酵產氫的研究，既可降低生產成本又可凈化環境.

4)暗－光發酵耦合系統的協同系統的生態共融性問題.暗光發酵2種細菌在生長速率、酸的耐受力等方面存在巨大差異，而且暗發酵產酸速率快，致使體系pH急劇下降，嚴重抑制光發酵細菌的生長，產氫效率降低，這也是混合培養產氫的瓶頸問題.如何使二者充分利用各自優勢，發揮互補功能，解除彼此間的抑制及產物的反饋抑制，提高氫氣生產能力、底物轉化范圍和轉化效率，是亟需解決的問題.需要研究者不斷的分離篩選同一生態位的光發酵和暗發酵細菌或改進產氫條件，優化產氫系統，使二者能夠更好地發揮協同產氫作用，使之能夠在同一系統中共存，實現真正意義上的底物的梯級利用，深度產氫.

5 前景分析

人類賴以依存的化石能源將消耗殆盡，而氫氣正是目前最理想的清潔燃料之一.目前，氫燃料汽車、氫燃料電池等都是以氫氣作為化石能源的替代品.人類對氫燃料的需求也將越來越多，石油、化工、電力、化纖等行業都大量使用氫，強大的市場需求必將加快氫氣工業產業化發展的步伐.氫氣必將成為后化石燃料時代的能源主要供應方式之一.

氫氣作為能源是現代經濟與可持續發展的需要.目前，從煤、石油和天然氣等化石燃料中制取氫氣已初具規模，但從長遠觀點看，不符合可持續發展的需要.成本高是生物制氫技術沒有產業化的主要問題，我國可用于生物制氫的原料非常多，如利用工業廢棄物、城市污水、生活垃圾、動物糞便等有機廢物以及秸稈等含纖維素類生物質發酵制氫，可大大降低生產成本.暗光發酵耦合生物制氫技術可將廢水處理、太陽能利用和清潔能源生產三者有機結合，并形成一種新型的環保企業.因此，無論從環境保護，還是從新能源開發、可持續發展的角度來看，發酵法生物制氫技術都具有很大的發展潛力.

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