RP-HPLC法測定老年咳喘片中補骨脂素和異補骨脂素的含量

覃建明，莫文電（1.廣西河池市人民醫(yī)院藥劑科，河池市 547000；.廣西河池市藥品檢驗所，河池市547000）

老年咳喘片由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補骨脂制成，具有滋陰壯陽、扶正固本的功效，可以提高人體免疫能力，促進病體康復(fù)，用于治療老年慢性支氣管炎及各種體虛癥。補骨脂含香豆精類、黃酮類、單萜酚類以及揮發(fā)油、皂苷、多糖、類脂等成分。補骨脂素和異補骨脂素為香豆精類，在補骨脂中含量較高。因此，筆者選取補骨脂素和異補骨脂素作為定量指標(biāo)來控制本品質(zhì)量，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法[1～4]測定其含量，并證明該方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于老年咳喘片的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATVPHPLC儀、SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津公司）；威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站（深圳深軟電子有限公司）。

1.2 試藥

補骨脂素對照品（批號:110739-200613）、異補骨脂素對照品（批號:110738-200410）由中國藥品生物制品檢定所提供；老年咳喘片（規(guī)格:基片重0.3 g；批號:080101、081002、081201、090301等10批）及缺補骨脂的陰性樣品由廣西某藥廠提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相:甲醇-水（55∶45）；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:246 nm；柱溫:30 ℃；進樣量:10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含20μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率160 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

取不含補骨脂的陰性樣品，照“2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按上述色譜條件各進樣10μL，分別記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液在與對照品溶液補骨脂素和異補骨脂素峰的保留時間處有相應(yīng)的色譜峰，均達到基線分離；陰性對照溶液無補骨脂素和異補骨脂素的吸收峰。色譜見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

精密稱取補骨脂素對照品9.4 mg、異補骨脂素對照品9.2 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取此貯備液0.5、1、2、5、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進樣10 μL，測定。以進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為Y補骨脂素＝7.121 1×106X+5.196 9×103（r＝0.999 9）；Y異補骨脂素＝7.158 9×106X+5.149 5×103（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，二者進樣量依次在0.047 0～0.940 0、0.046 0～0.920 0 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗

取混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果，補骨脂素、異補骨脂素峰面積的RSD分別為0.87%、0.63%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取室溫放置的同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、12 h進樣10 μL，測定補骨脂素、異補骨脂素的峰面積。結(jié)果，二者RSD依次為1.65%和1.02%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批（批號:090301）樣品6份，同法測定。結(jié)果，補骨脂素的平均含量為0.116 mg·g-1，RSD＝0.93%；異補骨脂素的平均含量為0.125 mg·g-1，RSD＝0.81%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 耐用性試驗

取同一供試品溶液，用2根不同廠家的C18色譜柱（另一根色譜柱為依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分別以流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1進行測定。結(jié)果，補骨脂素、異補骨脂素峰面積的RSD依次為1.04%、1.13%（n＝6），表明方法耐用性良好。

2.11 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號:090301）9份，分成3組，按高、中、低3個不同濃度分別精密加入一定量的混合對照品貯備液，水浴蒸干，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依上述方法測定，計算加樣回收率。結(jié)果，補骨脂的平均回收率為97.70%，RSD＝0.89%（n＝9）；異補骨脂素的平均回收率為98.76%，RSD＝0.84%（n＝9）。

2.12 樣品含量測定

取10批樣品，按上述色譜條件進樣，依法測定含量，每批測定3份，結(jié)果見表1。

表1 樣品中補骨脂素和異補骨脂素含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 1 Content determination of psoralen and isopsoralen in Laonian kechuan tablets（n＝3）

2.13 含量限度的擬訂

按正文擬訂的含量測定方法測定本品10批樣品中補骨脂素、異補骨脂素的含量，發(fā)現(xiàn)2種成分含量比例差別較大，結(jié)合實際考慮，以總含量來擬訂測定限度。10批樣品中補骨脂素和異補骨脂素的總含量分別是每片77.0、63.3、70.3、64.6、57.6、77.1、80.5、58.2、79.8、72.7 μg，其中總含量最高的是每片80.5 μg，最低的是每片57.6 μg，平均總含量為每片70.1 μg。因此，擬訂本品每片含補骨脂以補骨脂素（C11H6O3）和異補骨脂素（C11H6O3）計，總量不得少于60 μg。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，分別加流動相使溶解，在紫外分光光度計上掃描。結(jié)果，補骨脂素對照品在246.2 nm波長處有最大吸收，異補骨脂素對照品在246.4 nm波長處有最大吸收，故選擇246 nm為檢測波長。

3.2 提取溶劑及提取條件的選擇

根據(jù)補骨脂素、異補骨脂素易溶于甲醇、乙醇等溶劑的物理特性，本試驗選用甲醇作為提取溶劑；經(jīng)回流和超聲處理比較，結(jié)果用甲醇為溶劑超聲處理，可達到完全提取的目的。通過對超聲時間15、30、40、50 min的考察，發(fā)現(xiàn)提取40 min與50 min時樣品中補骨脂素、異補骨脂素的含量無明顯差別，故選用超聲提取40 min。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:129、130.

[2]許 菊.HPLC法測定腰痛丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中國藥師，2009，12（8）:1 077.

[3]鄧亞利，周莉玲.HPLC測定血寶片中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中成藥，2008，30（2）:278.

[4]田金改，杜慶鵬，王慰新，等.HPLC法測定復(fù)康寶膠囊中補骨脂素與異補骨脂素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（1）:39.