秸稈糖化復合菌系的篩選方法及糖化效果評價

劉 冰，徐誠蛟，王愛杰

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，哈爾濱150090，waj0578@hit.edu.cn; 2.沈陽農業大學土地與環境學院，沈陽110866;3.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱150030)

從19世紀70年代的石油危機開始，利用有機廢物產生生物質能被認為是一個重要的產能途徑［1］.我國是農業大國，每年產生大量纖維素類的農業廢棄物，利用生物手段將其轉化為高附加值的生物質能成為研究熱點［2］.其中，降解纖維素產糖是這項研究的核心內容之一［3－5］.在人們追求糖產量的同時，如何能更準確的將產出的糖量測定出來成為一個熱點問題.由于在復合菌系內，微生物對還原糖利用的瞬時性，通過測定反應體系中殘留的還原糖量，很難準確的評價其糖化能力.本試驗采用分室同步糖化發酵產氫的培養模式，將從高溫堆肥中篩選得到降解水稻秸稈的復合菌系，與實驗室原有只能代謝單糖高產氫菌株YUAN-3(Ethanoligenens harbinense)［6］分室同步糖化發酵培養，以單獨利用葡萄糖為底物發酵時，產生氫氣與所消耗葡萄糖的比例關系為對照，研究同步培養時復合菌系降解秸稈產生還原糖的能力，從而對厭氧纖維素降解菌系生物糖化效果進行評估.

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養基配制

復合菌系分離樣品取自高溫牛糞堆肥.實驗室原有菌株YUAN－3(E.harbinense)，該菌株有較強的產氫能力，同時又具備自凝集特性，該菌僅能利用單糖產氫.試驗所需培養基分別為:秸稈培養基(L－1):NH4Cl 1.0 g，K2HPO43.5 g，KH2PO41.5 g，MgCl20.5 g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，酵母粉2.0 g，秸稈 5 g，維生素液［7］5 mL，微量元素溶液［7］1 mL，刃天青1.5 mg，pH 7.0.YUAN-3培養基［8］.濾紙液體培養基［9－10］.將各種培養基分裝于血清瓶內，全過程在氮氣的保護下進行，121℃，20 min高壓滅菌.

1.2 產糖復合菌系的富集與篩選

1.2.1 復合菌系的富集

取高溫堆肥樣品10 g，在氮氣保護下，投入裝有數顆玻璃珠的無氧無菌水中，在振蕩器中振蕩1 h，利用玻璃珠剪切力將堆肥樣品粉碎，使微生物菌體充分分散于體系中.再將混合體系接種于秸稈培養基中，接種量10%，35℃靜止富集培養10 d，連續轉接兩次，使降解纖維素菌株大量富集.

1.2.2 秸稈降解效果

采用濾紙崩解法.將富集得到的菌群接入到濾紙培養基中培養，濾紙在配制培養基前需烘干恒重后稱重，接種量為10%，35℃、120 r/min振蕩培養，7～10 d后，烘干稱重，測量濾紙的崩解情況.反復轉接3次，比較濾紙崩解的效果.

1.2.3 連續稀釋轉接篩選高產糖復合菌系

將篩選得到的利用濾紙效果好的菌系用無菌水進行梯度稀釋，取稀釋度為10－3～10－9的溶液分別接種到水稻秸稈培養基中，35℃培養箱培養.每隔24 h小時取樣，采用DNS比色法［11－12］測定還原糖量.總結數據，當還原糖量升高，及時將該稀釋度培養體系再度稀釋至10－3～10－9，分別接入到新鮮秸稈培養基中液體培養，如此連續稀釋以得到高產糖復合菌系.

1.3 產糖效果評價方法及裝置

為更好的研究降解纖維素復合菌系的產糖效果，將其與已知菌株YUAN－3進行分室同步糖化發酵，根據復合菌系與YUAN－3分別培養時，產生單位體積H2時的底物利用率，研究分室同步培養條件下復合菌系的產糖效果.將篩選得到產糖效果較好的復合菌系接種于如圖1所示反應器的A室，B室接種YUAN－3，A、B兩室以0.45 μm細菌濾膜分隔，單室容積32 mL，裝液量80%，以添加于A室的水稻秸稈段為惟一碳源，流加無碳源培養液，采用單批培養方法，以分別單室培養為對照，測定反應器A、B室及對照產氫量變化規律，對照的葡萄糖消耗量，反應體系內還原糖含量殘留量.氫氣測定、發酵液相末端代謝產物的測定采用美國安捷倫7890型氣相色譜儀測定.色譜柱:TDX－02;柱溫:100℃;汽化室:80℃;檢測器100℃.

圖1 雙室反應器裝置簡圖

1.4 復合菌系糖化能力計算與秸稈降解率測定

分別測定復合菌系和YUAN－3在單室反應器中，累積產氫量與葡萄糖消耗量，并根據兩者的比例關系擬合成回歸曲線方程.再將雙室反應器中復合菌系和YUAN－3的產氫量分別代入方程，求得不同時間產生一定體積的氫氣，所需消耗的還原糖量，以此來表述復合菌系降解秸稈的產糖效果.秸稈降解率=(原始秸稈質量－殘留秸稈質量)/原始秸稈質量×100%.

2 結果與討論

2.1 復合菌系的富集結果

富集得到的復合菌系JY在水稻秸稈培養基中能夠生長，說明具有降解纖維素能力.分別觀察其在濾紙培養基中培養7，9，11 d后的濾紙崩解程度，通過培養觀察得到，圖2中復合菌系JY在第11天能將濾紙完全降解成糊狀，說明其具有較好利用纖維素底物的能力.

圖2 濾紙崩解效果

2.2 篩選到的復合菌系及其產糖效果

將復合菌系 JY進行梯度稀釋后接種于50 mL秸稈培養基，每天測定反應體系內還原糖產量，當產糖量升高時，說明利用秸稈的厭氧產糖微生物活躍，及時稀釋轉接，如此反復，從而得到產糖量較高的復合菌系.從表1看出，在稀釋培養后的第2天，所有稀釋度還原糖量均有所下降，下降最快為JY6(JY稀釋為10－6)，而在第3天其還原糖量又迅速上升，達到0.088 5 mg/mL.此時將JY6再進行梯度稀釋轉接，轉接后的第2天，JY66(JY6稀釋為10－6)還原糖含量迅速上升達到0.148 6 mg/mL.再將JY66再進行梯度稀釋，同樣在轉接后的第2天，JY665(JY66稀釋為10－5)的還原糖含量上升達到最高值0.165 6 mg/mL，而后還原糖量開始下降.由此可見，通過測定還原糖量并及時稀釋轉接，可以將復合菌系的微生物結構向產糖微生物更活躍，產糖效率更高的方向馴化.得到一個降解纖維素產糖能力較強的菌系，并且產糖量會在接種后的第2天達到最大值.結果還表明，稀釋度10－5或10－6對復合菌系內的產糖類群具有較好的分離度，即產糖微生物類群占所在菌系的比例較高，而隨時間推移，產生的還原糖很快會被其它微生物類群利用，還原糖含量隨即下降.

2.3 復合菌系的產糖效果評價

利用DNS法只能測得體系中殘留的少量還原糖，無法反應菌系降解秸稈過程中，產生還原糖的量和變化動態.本研究利用同步分室培養的方法，利用反應器中氫產量來推算菌系降解秸稈產糖能力.

將產糖效果較好的復合菌系JY665接種于雙室反應器A室，將菌株YUAN－3接種于B室，以利用單室反應器分別培養JY菌系和YUAN－3作為對照，35℃下振蕩培養80 h.將JY復合菌系和YUNA－3對照產氫體積(ml)對消耗葡萄糖的質量(g)擬合方程，分別為Y=－0.000 5x2+ 0.012 1x+0.011 3(R2=0.934 3)和Y=－0.000 07x2+ 0.006 4x+0.001 3(R2=0.999 6)，且擬合度較高(如圖3).

圖3 產氫量對葡萄消耗量擬合曲線

圖4 反應器產氫氣變化動態

雙室反應器JY復合菌系和YUAN－3，80 h累積產氫氣量如圖所示，80 h時產氣累積量達到最大值分別為9.45 mL和14.40 mL.其中JY復合菌系產氣量穩步上升，而YUAN－3則呈波動上升，可能是由于還原糖透過細菌濾膜時不均勻擴散造成的.YUAN－3的產氫起始時間為20 h，而JY復合菌系為32 h，說明由于JY的菌系復雜性使還原糖被消耗而產氫起始時間滯后.將反應器雙室所產生氫氣量(圖4)代入JY復合菌系和YUNA－3對照的回歸曲線方程，得到反應體系內還原糖消耗量的變化值，并與利用DNS法測得的反應器殘留還原糖值進行對比.

結果(圖5)表明，JY復合菌系和YUAN－3在發酵過程中所消耗的還原糖量在不斷升高，在80 h時達到最大值，分別為0.081 0 g和0.083 8 g，總還原糖消耗量達到了0.164 8 g.水稻秸稈添加量為0.320 0 g，培養結束后水稻秸稈殘留為0.124 6 g，據此JY復合菌系，產糖能力達到0.515 0g/g秸稈，秸稈降解率達到61.06%.

圖5 反應器產生及殘留還原糖量

同時，利用DNS法測定了反應體系中的殘留的還原糖量，反應器內JY復合菌系和YUAN－3還原糖含量均較低，最高值也分別只有3.310 mg和3.005 mg，且動態變化并不規律.結果表明，在秸稈降解的過程中，可能還原糖在產生后便被及時利用，很難在反應體系發現糖的殘留.由此可見，以產生一定體積氫氣所消耗的葡萄糖量，來表述復合菌系降解秸稈產生的還原糖量是可行和有效的.

3 結論

1)利用連續稀釋轉接法，篩選得到能夠降解水稻秸稈產糖的復合菌系JY665，該菌系35℃條件下降解纖維素產糖效果較好.將所得菌系JY665與產氫菌YUAN－3分室同步糖化培養，以單獨培養時氫氣產量對還原糖消耗量擬合曲線方程，代入反應器產氫量得到復合菌系產糖能力達到0.515 0 g/g秸稈，秸稈降解率達到61.06%.

2)通過擬合產氫體積與消耗葡萄糖量之間的曲線方程，采用分室同步糖化發酵法，以反應體系產氫量推知降解秸稈產生還原糖量，建立了一套關于復合菌系產糖能力的間接評價方法，并驗證了該方法的可行性.

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