高效絮凝菌的鑒定及絮凝特性研究

常玉廣，馬 放，王 博，王弘宇

(1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，哈爾濱150090，changyuguang@yahoo.com.cn; 2.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，南京211171)

微生物絮凝劑是微生物在發酵過程中分泌的高分子聚合物，其主要成分為多糖［1］、蛋白質、糖蛋白和DNA等［2－4］，具有高效，無毒，絮凝效果好等特點，對一些工業廢水、河水、泥漿廢水等有較好的絮凝效果.因此，利用微生物發酵產生新的復合型生物絮凝劑的前景非常廣闊［5－8］.

近年有關生物絮凝劑的報道較多，但大部分研究集中于微生物絮凝劑的發酵效果、特性、影響因素的水平，因而能否培育出高效的優良絮凝菌種，是今后的主要研究方向，國內外學者已篩選到了細菌、真菌等幾十種高效的生物絮凝劑產生菌株［9－10］.由哈爾濱工業大學馬放教授率先提出的“復合型生物絮凝劑”的概念［5］，是以稻草、秸稈等廉價生物質材料為底物，利用纖維素降解菌群和絮凝菌群組成的復合型微生物絮凝劑產生菌菌群，進行兩段式發酵后分離提取而獲得生物絮凝劑.本文是在“復合型生物絮凝劑”概念的基礎上開展深入研究，從基因水平鑒定絮凝微生物及對其進行分類，并且對產絮菌最佳菌群的構建、絮凝試驗以及絮凝成分進行了研究.這不僅是對“復合型生物絮凝劑”概念的實際應用，也為研究絮凝機理及復合型生物絮凝劑的開發提供了有利的理論基礎.

1 試驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

高效絮凝菌來源于含油廢水曝氣池污泥中的泥樣，是由黑龍江省環境生物技術重點實驗室分離開發的.

1.1.2 培養基

篩選培養基:每升含葡萄糖10 g，K2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO42 g，NaCl 0.1 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，pH7.5.絮凝菌分離培養基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基［11］.

1.2 絮凝活性測定

取5 g高嶺土加至1 000 mL的燒杯中，然后依次加入自來水1 000 mL，10%的CaCl2溶液1.0 mL和10 mL發酵液，并且調節溶液 pH至7.2，之后將燒杯溶液放在攪拌儀上攪拌(快攪、慢攪)使之充分混合，靜置 20 min后于波長550 nm處測定吸光度(B).以蒸餾水代替培養液作空白對照，于波長550 nm處測定吸光度(A).

通過絮凝率F來表示絮凝活性，公式如下［12］

1.3 16SrDNA序列的擴增和分析

1.3.1 絮凝菌基因組DNA的提取

方法參照文獻［13］.

1.3.2 16SrDNA序列的PCR擴增反應

PCR反應以基因組DNA為模板，用通用引物擴增16SrDNA片段.正向引物為BSF8/20:5＇－AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG－3＇;反向引物為BSR1541/20:5'－AAGGAGGTG AACCAG CCGCA－3'，引物由大連寶生物公司合成.PCR反應體系(100 μL)為:10×Buffer 10 μL，dNTP 8 μL，引物BSF8/20 3 μL，引物BSR1541/20 3 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，dH2O 74.5 μL.反應程序: 94℃預變性4 min;94℃變性1.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環;然后72℃延伸10 min.PCR產物與克隆載體pMD18—T連接后，由大連寶生物基因公司測序.

1.4 絮凝菌系統發育樹的構建

將測得的6株絮凝菌株的16S rDNA序列通過BLAST程序在GenBank數據庫上進行相似性比對分析，調出同源性99%的菌株16SrDNA序列，并利用序列比對軟件ClustalX1.8、系統發育分析軟件PHYLIP3.6及進化樹生成軟件Treeview構建系統發育樹和序列同源性的比較.

1.5 絮凝菌的菌群構建

將絮凝菌按照(1∶1)比例進行每兩株復配培養，測其絮凝率.

1.6 絮凝劑的成分分析

用紅外光譜掃描分析絮凝劑中的特征基團，確定絮凝劑中的有效成分.

1.7 絮凝劑的成分分析

將絮凝劑粗品分別用紫外掃描測定蛋白質、核酸;用紅外光譜掃描分析絮凝劑中的特征基團，確定絮凝劑中的有效成分.

2 結果與討論

2.1 絮凝菌的形態特征與生理生化測定

將6株絮凝菌編號為:F1、F2、F3、F4、F5、F6.

圖1 絮凝菌的電鏡觀察圖

由透射電鏡觀察(圖1)，6株菌中只有F1為球狀菌，其余為桿狀菌.這些菌株的菌落形態都是圓形，直徑較大，表面都光滑，顏色多為乳白色，只有F1菌落為桔紅色，絮凝菌的形態特征見表1，生理生化特性分析見表2，并參照伯杰氏菌種鑒定手冊，對6株絮凝菌進行菌種鑒定，初步確定F1為庫克菌屬(Kocuria sp.)，F2為農桿菌屬(Agrobacterium sp.)，F3、F4、F5、F6為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.).

表1 絮凝菌體的形態特性

表2 絮凝菌的生理生化特性

2.2 構建系統發育樹

測序結果表明:F1、F2、F3、F4、F5、F6的16SrDNA的核甘酸序列為1 518 bp、1 478 bp、1 477 bp、1 477 bp、1 544 bp、1 544 bp(圖2).

圖2 絮凝菌的16S rDNA序列系統發育樹

將6株絮凝菌的16SrDNA序列用BLAST軟件與GenBank中已發表的16SrDNA序列進行同源性比較，選取同源性在95%以上的細菌序列.根據16S rDNA序列同源性構建系統發育樹，從進化樹可以看出，6株絮凝菌分別與 Bacillus sp.、Agrobacterium sp.、Kocuria Polaris各歸為同一簇族群.其中F3、F4、F5、F6最接近于Bacillus sp.，該菌株在系統發育地位上屬于芽孢桿菌屬.F1接近于庫克菌屬 Kocuria sp.，F2與農桿菌屬Agrobacterium sp.歸為同一族群，利用BLAST的序列比對結果表明，各菌株與相似性菌屬的相似性均為99%.結合菌株的形態學和生理學特性，可基本確定分離的菌株的屬為 Bacillus sp.、Agrobacterium sp.、Kocuria sp..

2.3 絮凝活性的測定

由絮凝菌的電鏡照片來看，F5菌株和F6菌株有大量的粘液性物質產生，細菌易粘連在一起，形成膜狀物質，說明這兩株菌的分泌代謝很旺盛，而絮凝效果的產生也是來源于微生物的代謝產物，有報道具有絮凝活性的細菌多數均形成胞外多糖［14］.因此，在絮凝菌發酵液中含有影響絮凝活性的物質.結果表明，絮凝率達69%以上，其中4株絮凝率在80%以上，分別為F2、F3、F5、F6.在混凝過程中，菌株F2的發酵液混凝產生的礬花大，沉降速度快，從圖3可以看出，F2絮凝率最高，其他菌株也同樣表現了高絮凝特點.

圖3 絮凝菌的絮凝率示意圖

2.4 絮凝菌的菌群構建

將絮凝率高于80%的4株絮凝菌F2、F3、F5、F6按照(1∶1)比例進行每兩株復配培養，測其絮凝率.盡管這4株菌單獨培養時絮凝率都在80%以上，但從表3可以看出，每兩株菌混合培養之后，并不是絮凝率都有所提高，有的反而降低了.根據生態位的理論［7］，不同菌株能夠在一起共存，是因為它們之間通過協調作用出現了生態位的分離，從而避免了種群間激烈的競爭.因此，混合培養絮凝率較單株菌培養有所降低，這兩株菌之間存在生態位的重疊，導致它們不能共同生長或生長力下降，影響了代謝產物的增加，也就是絮凝活性物質減少，從而絮凝率降低;而F2和F6的混合培養后的絮凝率較原來有一定的提高，說明它們能夠在一起共同生長，其生態位出現了分離，所以絮凝率提高.由表3可以看出:F2和F6菌株組合所得發酵液絮凝率為93.1%，其效果優于其他各組，同時也優于各個單菌.這可以由生態位來解釋，另外，在Kurane R和Matsuyama研究結果中也有闡述，混合培養的條件下不同微生物之間的相互作用促進微生物絮凝劑的產生［15］.因此，采用F2和F6作為復合型生物絮凝劑產生菌，用于生產復合型生物絮凝劑，并對這兩株菌進行進一步的研究.

2.5 復合型生物絮凝劑的絮凝活性分布

對復合型生物絮凝劑F2和F6的發酵原液、上清液、細胞懸浮液三者的絮凝率進行了測定.由圖4可知，發酵原液活性最高，為96.61%，分別高于上清液、細胞懸浮液1.91%，35.53%.通過絮凝率的測定可知上清液的絮凝率很高，說明絮凝活性物質主要存在于上清液中，生物絮凝是利用微生物細胞代謝產物的絮凝劑，絮凝劑有效成分存在于發酵液中.而細胞懸浮液絮凝的效果較低(相對絮凝劑的效果)，表明絮凝菌產生的胞外物大部分分泌至胞外液中.因此，在后續的實驗中，以發酵上清液為對象，來研究生物絮凝劑的分離純化.

表3 不同兩株絮凝菌混合培養的絮凝率

圖4 絮凝活性分布圖

2.6 復合型微生物絮凝劑的成分分析

2.6.1 紫外掃描分析

絮凝菌發酵液上清液的紫外掃描結果見圖5.曲線為平滑曲線，沒有特征吸收峰(蛋白質在280 nm有吸收峰，核酸在260 nm有吸收峰)，說明絮凝劑中幾乎不含有核酸和蛋白質.因此，可以定性地判斷該絮凝劑的有效成分不是蛋白質或核酸.

2.6.2 紅外光譜掃描

將生物絮凝劑提純后進行紅外光譜掃描，結果見圖6.譜圖是較為典型的多糖紅外光譜圖，2 926 cm－1是C—H不對稱伸縮振動的結果，此區域的吸收峰是糖類的特征峰.1 647 cm－1是由于多糖中的乙酰氨基(—NHCOCH3)的C O鍵伸縮振動造成的.在圖中1 541 cm－1和1 508 cm－1處的峰為 N—H的變角振動，此峰說明多糖中的—NH—是乙酰化的.在3 443 cm－1處強而寬的吸收峰是分子內的—OH伸縮振動所導致的.1 733 cm－1為—COOH中的C O鍵伸縮振動的結果.在1 385 cm－1處為羧基—COO－中的C O對稱伸縮振動.1 063 cm－1的強吸收峰是酯內的C—O—C反對稱伸縮振動吸收譜帶.879 cm－1為呋喃糖或羥基呋喃環的吸收峰，是由環和取代基的伸縮振動及次甲基的橫向振動所致.因此，可以判斷CBF中含有羧基，分別以—COO－和COOH的形式存在.此外，將絮凝劑溶液攤放在平板玻璃片上，使其干燥成膜，結果發現，形成的薄膜韌性很強，從某種程度上表明絮凝劑的鏈型為線性.

圖5 紫外掃描圖譜

圖6 CBF的紅外光譜圖

3 結論

1)絮凝測定結果表明絮凝率達69%以上.其中4株絮凝率達80%以上，表明這6株絮凝菌具有很強的絮凝特性.

2)根據絮凝菌形態和生理生化特征鑒定及16SrDNA序列系統發育分析，Agrobacterium sp.與F2聚為一類，Bacillus sp.與絮凝菌F3、F4、F5、F6聚為一類，Kocuria sp.與絮凝菌F1聚為一類，序列同源性99%，但該6株絮凝菌尚不能定種，有待于進一步分析.

3)在菌群構建中，F2和F6菌株按照1∶1比例混合培養發酵液絮凝率可達93.1%，這種組合的復合型生物絮凝劑絮凝率優于各個單菌的絮凝率，也優于其他雙菌組合.

4)在絮凝劑的成分分析中，紫外掃描圖譜分析絮凝劑中不含有蛋白質和核酸，紅外光譜分析絮凝劑的有效成分為多糖類物質.

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