生物增強活性炭工藝中優勢菌群生物活性強化

郜玉楠，李偉光－3，王廣智，張多英，劉 水

(1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，哈爾濱150090，gaoyunan01@163.com;2.哈爾濱工業大學城市水資源開發利用(北方)國家工程研究中心，哈爾濱150090;3.哈爾濱工業大學水資源與水環境國家重點實驗室，哈爾濱150090)

生物增強活性炭技術(bio-enhanced activated carbon，BEAC)是現代生物技術研究內容之一，其核心就是從自然界中篩選構建優勢菌群，增強生物降解作用，保持生物活性炭工藝的長期穩定性，提高對污染物的去除效率［1］.由于自然水體中生物相非常復雜，微生物的種類和數量較多，營養基質較少，從水體中篩選出的菌種活性很低，無法有效地降解污染物，且人工固定化活性炭上生物量較少，因此，進行菌群生物活性強化是有必要的.在飲用水處理中［2－4］，優勢菌群生物活性的強化就是通過從富營養到貧營養，再從貧營養到富營養而后再到貧營養的變化過程，最終使篩選出的菌株能夠在微量有機物的水體中生長，提高菌種活性.微生物菌種生物活性的強化過程實際上是菌種的誘導變異過程，反復經過營養的變化，菌種具備了適應水質波動的貧營養環境，這樣菌種被固定到活性炭上后，才能夠保持旺盛的生物降解能力［5］.

本文研究培養溫度、pH值、培養時間和氧含量因素對優勢菌群脫氫酶活性的影響，從而確定優勢菌群生物活性強化的最優培養條件，并在優化條件下通過貧富營養交替的方式強化優勢菌群的生物活性，以PCR－DGGE技術比較了優化條件與未優化條件下強化的優勢菌群在活性炭上的生物量固定情況.

1 試驗

1.1 優勢菌來源

從松花江水中篩選出5株具有降解有機物效果的菌種，經鑒定分別為Pseudomonas balearica，Pseudomonas putida，Acinetobacter calcoaceticus，Acinetobacter lwoffii，Brevibacterium mcbrellneri.

1.2 培養基

Ⅰ:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min;Ⅱ:蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅲ:葡萄糖 10 g，NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅳ:NaCl 5 g，松花江水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

Ⅴ:NaCl 5 g，松花江水砂濾出水1 000 mL，112℃滅菌20 min.

1.3 試驗方法

優勢菌群最優培養條件確定:通過I號培養基，研究不同培養條件下，即培養溫度(13～38℃)、pH值(3～10)、培養時間(12～72 h)、溶解氧質量濃度(4～9 mg/L)，優勢菌群脫氫酶活性的變化規律.

優勢菌群生物活性強化試驗:在已確定的最佳生長條件下，利用不同濃度梯度營養成分的強化培養基(I、Ⅱ、III、Ⅳ、V)，對優勢菌群進行反復強化，強化培養采用半連續馴化培養法，其過程為:將待用菌株的斜面用10 mL無菌水洗脫，然后各取2 mL菌液分別接種于裝有已滅菌的100 mL培養基I中，再置于搖床上.吸取菌株培養基I的培養液10 mL，分別加入盛有100 mL培養基Ⅱ的玻璃瓶中，置于搖床上培養.依次按上述量和培養方法，將菌株的培養液分別加入培養基III、Ⅳ、V中，最后加入已經滅菌的水中［6］.

試驗重復進行3次，圖表中所得結果為3次實驗平均值.溶解氧參數變化控制采用加氧泵進行曝氣，試驗裝置如圖1所示.

圖1 優勢菌群生物活性強化的溶解氧控制試驗裝置

1.4 檢測方法

生物活性檢測方法采用脫氫酶活性法，選用無色的氯化三苯基四氮唑(TTC)受氫后變成紅色的三苯甲基(TF)，然后利用比色法做定量分析［7－8］.取培養后的混合菌液10 mL，置于離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，底部菌體用無菌水洗脫倒入比色管，進行脫氫酶測定.

2 結果與討論

2.1 溫度對優勢菌群脫氫酶活性的影響

研究不同溫度條件下優勢菌群脫氫酶活性的變化，培養條件為pH值7.0，培養時間為24 h，DO值范圍為6～8 mg/L，結果如圖2所示.溫度是影響微生物活性的主要因素，不同菌種相應的最佳生長溫度也不同，在適宜的溫度下，活化分子數增多，反應速度加快，從而使微生物的降解速度加快.中溫菌所產生的酶一般要求較高反應溫度，在低溫條件下酶活性降低，而來自耐冷菌細胞中的酶必須適應低溫環境，它們的分子結構能夠在低溫下保持較高的穩定性和催化活性［9］.試驗觀察優勢菌群在培養溫度為18～23℃范圍脫氫酶活性較高，培養溫度低于13℃和高于33℃時，優勢菌群脫氫酶活性較低，最佳溫度為18℃.

2.2 pH對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

微生物生長適宜pH值范圍較寬，不同微生物生長的最適pH值也有一定差別，并且各微生物生長的最適pH值與其分泌某種代謝產物的pH值通常是不同的，因此，確定優勢菌群最適pH值范圍可以提高優勢菌群的生物活性并在擴大培養中得到較高的菌量［10］.試驗研究pH值在3～10范圍內優勢菌群脫氫酶活性的變化規律，培養條件為溫度23℃，培養時間為24 h，DO值范圍為6～8 mg/L，結果如圖3所示.pH值范圍在5～9時優勢菌群脫氫酶活性較高，最適pH值為6，說明優勢菌群在偏酸性條件下有較高的活性.

圖2 溫度對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

圖3 pH對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

2.3 培養時間對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

圖4為優勢菌群隨培養時間變化的脫氫酶活性測定結果，培養條件為溫度23℃，pH值為7.0，DO值范圍為6～8 mg/L.0～24 h優勢菌群生長處于遲緩期，生物活性較低.當微生物細胞適應環境后，24～36 h處于對數生長期，生物活性迅速升高.42～54 h內，微生物細胞進入穩定期，生物活性變化不明顯，當培養60 h以后，由于環境中營養物質的不足，微生物進入生長的衰亡期，生物活性明顯降低，因此，最佳培養時間可確定為36 h.

2.4 溶解氧對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

由于試驗所選5株優勢菌均為好氧性微生物，氧作為在呼吸作用中的最終電子受體和供不飽和脂肪酸等的合成，其對優勢菌的生物活性有很大的影響［10］.圖5為優勢菌群培養過程中氧質量濃度對脫氫酶活性的影響，培養條件為溫度23℃，pH值為7.0，培養時間為24 h.可以看出，當培養液中溶解氧含量小于7 mg/L時，優勢菌群的脫氫酶活性隨溶解氧質量濃度增加而升高;當溶解氧含量大于7 mg/L時，優勢菌群脫氫酶活性升高趨勢減緩，脫氫酶活性維持在40～45 mg/(L·h)，因此，可確定優勢菌群最適生長溶解氧為7 mg/L.

圖4 培養時間對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

圖5 DO對優勢菌群培養中脫氫酶活性的影響

2.5 優勢菌群生物活性強化過程分析

圖6為兩種條件下優勢菌群生物活性強化過程，其中優化條件為溫度18℃，pH值為6，單一培養基培養時間為36 h，溶解氧質量濃度為6～7 mg/L.未優化條件為溫度23℃，pH值為6，單一培養基培養時間為24 h，溶解氧質量濃度為6～7 mg/L.可以看出，兩種條件強化過程在初始階段優勢菌群的生物活性均較低，從富營養化向貧營養化轉變的過程中，在較優條件下生長的優勢菌群生物活性首先有一定的增加，但是增加幅度不明顯，這說明菌種在馴化過程中出現一個適應過程，在這個適應過程中，雖然改變了培養基的類型，但是增強菌不能在短時間內適應這個變化，因而生物活性的增強受到了抑制.當馴化進行到貧營養的狀態時，即進入Ⅴ號培養基，增強菌的生物活性有所降低，這是由于培養基Ⅴ不含有微生物所需的營養物質，微生物的脫氫酶活動受到較大抑制.在第二階段由貧營養化向富營養化變化，從Ⅴ至Ⅲ的變化過程中，微生物活性迅速增加，這一階段微生物適應了營養水平的變化，微生物活性呈現出線性增加的狀態，在隨后的Ⅲ至Ⅰ的過程中，雖然營養物質水平增加了，但是生物活性增長幅度較小，因而可以認為馴化達到了終點，即使營養水平再變化也不會對微生物活性有較大改變.與優化條件相比，未優化條件下的優勢菌群生長活性變化較慢，適應性較差.

圖6 優勢菌群生物活性強化過程中脫氫酶活性的變化規律

2.6 優勢菌固定活性炭上PCR－DGGE分析

試驗采用PCR－DGGE技術［11－12］比較兩種條件下強化生物活性后的優勢菌群在活性炭上固定化的情況，測定得到的指紋圖譜見圖7.指紋圖譜中不同的陰影部分代表不同的菌種，而陰影帶的數目代表生物菌種的數目，每一條陰影都代表不同的生物菌種，而陰影的深淺可以定性地代表其所指征的菌種的數量.可以看出，泳道A圖代表優化條件下生物活性強化的優菌群固定化結果，泳道B代表未優化條件下生勢物活性強化的優勢菌群固定化結果.泳道A圖與B圖均有明顯的5個條帶，說明活性炭表面明顯呈現5株菌種，但優勢菌的數量有所不同，泳道A圖5株優勢菌的條帶陰影明顯比B圖5株優勢菌的條帶陰影淺，說明生物活性較強的優勢菌群固定在活性炭上的數量較多，有研究表明［13］微生物活性較高，其可分泌胞外多聚物的能力較強，這種粘性的胞外多聚物在細菌與載體間起到了生物粘合劑的作用，使細菌較為容易實現在載體表面的附著和固定.

圖7 PCR－DGGE分析結果

3 結論

1)優勢菌群在pH=6、溫度18℃、培養時間36 h、溶解氧7 mg/L條件下進行生物活性強化可以得到較高的脫氫酶活性.

2)根據PCR－DGGE分析結果，在優化條件下強化所得到高活性優勢菌群在活性炭上固定的數量明顯高于未在優化條件下生長的優勢菌群.

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