長壽老人源雙歧桿菌發酵雪蓮果飲料的研制

王 洋，劉寧晶，鄭海濤，王 銳，劉麗莎，呂銘洋，李平蘭*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083)

長壽老人源雙歧桿菌發酵雪蓮果飲料的研制

王 洋，劉寧晶，鄭海濤，王 銳，劉麗莎，呂銘洋，李平蘭*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083)

以長壽老人源動物雙歧桿菌01(Bifidobacterium animalis 01)發酵雪蓮果汁，研制一種新型雙歧桿菌活菌飲料。先以活菌數為響應值進行單因素試驗，篩選出3個具有顯著影響效應的因素——果汁體積分數、賴氨酸添加量、抗壞血酸(VC)添加量，并確定了各因素最大響應區間。然后采用響應曲面法旋轉中心組合設計(CCD)，Design expert 7.0軟件進行數據分析，建立二次線性回歸方程，得到最佳配方為雪蓮果汁體積分數50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。終產品感官品質良好，活菌數對數值高達到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，在4℃條件下貯藏12d活菌數保持在106CFU/mL以上。

雙歧桿菌；雪蓮果；發酵飲料；響應曲面法

雙歧桿菌(bifidobacteria)是一類重要的益生菌，在宿主體內發揮著調節腸道菌群、抑制有害菌、營養宿主、增強免疫、抑制腫瘤、延緩衰老等生理功能。雙歧桿菌制品是將雙歧桿菌經工業化擴大培養，再經口服回歸宿主原來的生境，發揮其益生功能的制品。近年來對雙歧桿菌保健制品的研究越來越多。在眾多雙歧桿菌制品中，雙歧桿菌和雙歧因子共同使用的合生元制劑效果最好。

雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)根莖含有豐富的果寡糖(約占干物質的60%～70%)[1]，大量的水溶性植物纖維以及18種人體必需的氨基酸。有促進腸道雙歧桿菌增殖[2]、改善腸道功能，增強微量元素吸收，調節血糖、血脂及抗腫瘤等保健作用。目前雪蓮果多生食，或作烹調輔料?？蒲腥藛T正在以雪蓮果為原料，研發一系列加工產品，如腌制品、風干片、糖果、飲料、乳酸菌發酵飲料等。 目前還沒有利用雙歧桿菌發酵雪蓮果汁制備活性飲料的研究報道。

本研究采用的動物雙歧桿菌01(Bifidobacterium animalis 01)菌株來源于廣西巴馬瑤族自治縣長壽老人腸道。前期研究發現其能耐受消化道逆環境[3]，且具有抗

氧化，富硒[4]等多種生理活性功能。B. animalis 01發酵雪蓮果汁活性飲品，兼備B. animalis 01和雪蓮果的保健功效，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雪蓮果 市售；動物雙歧桿菌01由中國農業大學食品科學與營養工程學院微生物實驗室提供，中國科學院普通微生物菌種保藏中心專利保藏編號1353。

1.2 培養基和果汁配制

種子培養基：MRS液體培養基[5]；計數培養基：添加X-gal(60mg/L)的MRS固體培養基。

滅菌的預還原雪蓮果汁制備工藝流程：雪蓮果→清洗→去皮→切分成3cm見方的小塊→預煮8min滅酶→加水打漿→均質(調節pH7.0)→充氮→滅菌(108℃，20min)。

1.3 種子、發酵雪蓮果汁制備及活菌計數

B. animalis 01凍干菌粉于預還原MRS液體培養基中活化3代，恢復活力。接入滅菌的預還原雪蓮果汁中，初始活菌數對數值為(5.91±0.07)lg(CFU/mL)，37℃厭氧發酵30h。活菌計數采取鑒別性亨蓋特厭氧滾管法[6-7]。

1.4 發酵果汁質量評價

1.4.1 發酵果汁感官評價

采用模糊數學七度標度法，由經過培訓的10人組成評分小組。評語論域為V=(1，2，3，4，5，6，7)，其中1為最難接受，2為較難接受，3為稍難接受，4為勉強接受，5為較易接受，6為容易接受，7為最易接受。發酵果汁的評定領域U=(色澤，香氣，酸度，甜度，苦澀味，組織狀態)，其對應的權重值為X= (0.15，0.20，0.20，0.15，0.20，0.10)[8]。

1.4.2 發酵果汁理化指標測定

可溶性固形物含量：參照GB 12143.1—88《軟飲料中可溶性固形物的測定方法》；VC含量：2,6-二氯靛藍滴定法[9]；還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》；總糖含量：苯酚硫酸法[10]；總酸含量：參照GB/T 12456—1990《食品中總酸的測定方法》(以乳酸計)。

1.4.3 發酵果汁4℃厭氧保藏過程雙歧桿菌活菌數量變化

發酵果汁于厭氧瓶中4℃保藏，每24h取樣，鑒別性亨蓋特厭氧滾管法計數雙歧桿菌。

1.5 試驗設計與數據處理

1.5.1 單因素試驗

依1.2節及1.3節方法制備發酵果汁，進行活菌計數。以發酵終點活菌數對數值為響應值，按照雪蓮果汁體積分數、碳源、氮源、生長因子順序，各因素在前一因素的最佳水平下進行逐級優化。在α=0.05的水平下進行單因素方差分析，判斷對發酵果汁活菌數的影響有統計學意義的因素及其最大響應水平范圍。

1.5.2 響應曲面法旋轉中心組合設計[11](response surface methodology central composite design)與數據分析

依據單因素試驗確定的因素及其水平范圍，以發酵果汁活菌數對數值為響應值，用Design Expert 7.0[12]軟件進行旋轉中心組合設計和結果分析，得到二次線性回歸方程，預測最優配方并驗證。

2 結果與分析

2.1 果汁體積分數對發酵果汁活菌數及感官品質的影響

活性發酵果汁需要具備良好的感官品質和較高的活菌數。在影響發酵果汁活菌數的各項單因素中，雪蓮果果汁體積分數對發酵終產品感官品質有顯著的影響(P＜0.05)，考察雪蓮果汁體積分數分別為20%、40%、60%、80%、100%時發酵果汁的感官品質。發現果汁體積分數為40%、60%、80%的感官得分是可以被大眾接受的(表1)，且果汁體積分數為60%時終產品感官得分最高；因此選擇40%～80%作為果汁最適濃度范圍，考察各濃度對發酵終產品活菌數的影響。圖1顯示，在果汁體積分數為60%時終產品活菌數顯著高于其他濃度(P＜0.05)，為(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。在60%果汁中添加碳源，發酵終點活菌數沒有提高，可能是雪蓮果汁中碳源豐富，能夠滿足雙歧桿菌生長的能量需求，故無需添加碳源。

表1 果汁體積分數對感官指標的影響Table 1 Effect of volume ratio of yacon juice on the sensory characteristics of the beverage

圖1 果汁體積分數對發酵果汁活菌數的影響Fig.1 Effect of volume ratio of yacon juice on growth of B. animalis 01

2.2 氮源對發酵果汁活菌數的影響

在體積分數為60%的果汁中添加各種氮源(復原乳、豆乳，添加量為1%；半胱氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸，添加量為0.1%)，結果表明，脫脂復原乳、豆乳、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸后對雙歧桿菌生長均有促進作用，其中酪氨酸、精氨酸、賴氨酸效果最為顯著(P＜0.05)。L-賴氨酸是人體必需氨基酸，且為絕大部分中國人的第一限制性氨基酸，故選用賴氨酸作為補充氮源。圖2顯示了賴氨酸的添加量對發酵飲料活菌數的影響，賴氨酸添加量分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1.0%。從圖2可知，賴氨酸的添加量對發酵終點活菌數的影響顯著(P＜0.05)，且活菌數隨其添加量的增大呈先增高后降低趨勢，在添加量0.25%時達到最大值(8.01±0.12)lg(CFU/mL)。

圖2 賴氨酸添加量對發酵果汁活菌數的影響Fig.2 Effects of lysine level on the growth of B. animalis 01

2.3 生長因子對發酵果汁活菌數的影響

圖3 抗壞血酸添加量對發酵果汁活菌數的影響Fig.3 Effects of ascorbic acid level on the growth of B.animalis 01

在果汁體積分數為60%、賴氨酸添加量0.25%的果汁中分別添加各種生長因子(硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鎂，添加量以金屬離子濃度計為1.5mmol/L；磷酸氫二鉀、氯化鈉、VC、吐溫80，添加量0.1%)。其中，氯化鈉、磷酸氫二鉀、VC對B. animalis 01的增殖有促進作用，且VC對試驗菌株的促生長效果最為顯著(P＜0.05)。進一步考察不同VC添加量(0.05%、 0.1%、0.2%、0.3%)對果汁發酵過程中雙歧桿菌活菌數的影響，隨著VC添加量的增大，發酵終點活細胞數逐漸增加，在VC添加量為0.20%時達到最高，對數值為(8.20±0.10)lg(CFU/mL)，添加量再增大，活菌數沒有顯著提高。

2.4 響應面法優化果汁配方

2.4.1 響應面旋轉中心組合設計結果

依據以上單因素試驗的結果，選取對發酵果汁活菌數影響最為顯著的3個因素——果汁體積分數、賴氨酸添加量、VC添加量，以發酵果汁活菌數對數值為響應值，進行響應面旋轉中心組合設計，各因素水平如表2所示，試驗設計與結果見表3。利用Design Expert 7.0軟件對表3結果進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

Y=8.25+0.11A－0.38B+0.0026C－0.0062AB+ 0.00831AC－0.033BC－0.11A2－0.083B2－0.035C2

式中：Y為發酵果汁活菌數對數值；A為果汁體積分數；B為賴氨酸添加量；C為VC添加量。

方程擬合系數0.98。對上述回歸方程進行方差分析(表4)表明，模型達到顯著水平，適合對不同配方的發酵果汁活菌數進行分析和預測。

表2 響應面旋轉中心組合設計因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of central composite design

表3 響應面旋轉中心組合設計與結果Table 3 Experimental design and results of central composite design

表4 響應曲面模型及其各項方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

2.4.2 發酵果汁配方的優化

利用Design-Expert 7.0軟件對表3數據進行二次多元回歸擬合，所得二次回歸方程的響應曲面圖和等高線見圖4，可以看出果汁體積分數和VC添加量，賴氨酸和VC添加量對響應值的交互作用顯著；果汁體積分數和賴氨酸添加量對交互作用不顯著。根據二次回歸方程，預測雙歧桿菌發酵雪蓮果汁的配方為雪蓮果汁體積分數50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。響應值8.26lg(CFU/mL)。按照此配方進行驗證實驗，活菌數可達到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，與模型預測值基本吻合，說明該研究所得出的模型是合理的。

圖4 各兩因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots showing the interactions of volume ratio of yacon juice, level of lysine and ascorbic acid

2.5 B. animalis 01發酵雪蓮果汁飲料質量評價

2.5.1 發酵飲料感官質量評價

以上述優化得到的最優配方制備發酵飲料并進行感官評定，結果見表5。

表5顯示，發酵后飲料的感官得分5.80，各項指標良好，說明是一種容易被大眾接受的飲料。

2.5.2 發酵飲料理化指標測定

表5 最優配方B. animalis 01雪蓮果發酵飲料感官評價得分表Table 5 Sensory characteristics of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6 最優配方B. animalis 01雪蓮果發酵飲料各項理化指標Table 6 Physico-chemical properties of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6為最優配方發酵飲料的各項理化指標測定結果?？梢钥闯觯l酵果汁可溶性固形物含量為(11±1)%、pH4.3、糖酸比為8.8:1。

2.5.3 發酵果汁貯藏過程雙歧桿菌活菌數變化情況

圖5 4℃厭氧保藏發酵果汁中雙歧桿菌活菌數隨時間的變化Fig.5 Survival of Bifidobacterium animalis 01 in the yacon beverage during storage at 4 ℃

由圖5可以看出，發酵果汁在貯藏過程中雙歧桿菌活菌數量緩慢下降，在12d內雙歧桿菌活菌數仍保持在1.0×106CFU/mL(GB 16321—2003《乳酸菌飲料衛生標準》對乳酸菌飲料中乳酸菌活菌數的最低限量)以上。

3 討 論

雪蓮果富含雙歧因子低聚果糖，B. animalis 01在單純雪蓮果汁中生長活菌數為(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。氮源的添加能夠顯著促進雙歧桿菌的生長，在60%果汁中添加0.1%賴氨酸，發酵終點活菌數提高到(8.01±0.08) lg(CFU/mL)。0.20% VC的添加，使活菌數進一步上升到(8.20±0.10)lg(CFU/mL)。經響應面法優化得到最優配方為雪蓮果汁體積分數50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。該配方發酵終點活菌數達(8.23±0.09) lg(CFU/mL)。

雙歧桿菌對營養要求嚴格，在營養豐富的培養基中生長活菌數在108～109CFU/mL，如嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌在補充了碳源的豆漿中生長，最高活菌數分別為8.50CFU/mL和7.93lg(CFU/mL)[13]。動物雙歧桿菌乳亞種Bb-12在MRS中生長最高活菌數為8.61lg(CFU/mL)[14]。長雙歧桿菌在乳中發酵24h活菌數8.79lg(CFU/mL)[15]，陳佩等[16]研制的胡蘿卜紅棗雙歧桿菌發酵乳飲料的活菌數高達109CFU/mL?？梢姡狙芯拷K產品的活菌數數量級為108，活菌數較高，且仍有提高的空間，若在本研究的基礎上，在雪蓮果汁中加入其他果蔬汁成分，有可能得到活菌數更高且風味優良的復合發酵果汁。不同雙歧桿菌在同一種培養基中生長情況相似，如動物雙歧桿菌乳亞種Bb-12、兩歧雙歧桿菌B7.1、兩歧雙歧桿菌B3.2發酵胡蘿卜汁，最高活菌數為8.22～8.96lg(CFU/mL)[17]。本研究所得的配方可能適合多種雙歧桿菌的生長，為開發一系列雙歧桿菌發酵雪蓮果汁活性飲品提供參考。

保藏溫度對活菌飲品的貨架期有顯著影響，如嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌發酵豆漿在5℃保藏10d，活菌數分別下降了0.44、3.18lg(CFU/mL)，而在25℃保藏，活菌數很快降低到106CFU/mL以下[13]。B. animalis 01發酵雪蓮果汁飲料在4℃厭氧可保存12d，活菌數保持在106CFU/mL以上。作為一種不經過二次殺菌的貨架期較短的活菌飲品，該發酵飲料適宜采取冷鏈銷售模式。

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Preparation of Fermented Yacon (Smallanthus sonchifolius) Beverage using Bifidobacterium Strains from Centenarians , Faeces

WANG Yang，LIU Ning-jing，ZHENG Hai-tao，WANG Rui，LIU Li-sha，L. U . Ming-yang，LI Ping-lan*
(Key Laboratory of Function Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The yacon (Smallanthus sonchifolius) juice was fermented with Bifidobacterium strains derived from centenarians, faeces (Bifidobacterium animalis 01) to prepare a functional beverage. The effects of volume ratio of yacon juice, concentration of lysine and ascorbic acid on the viable bifidobacteria numbers in the fermentation broth were studied by conducting single factor tests. Subsequently, a central composite design involving the above 3 factors at 5 levels was employed and analyzed by response surface method to optimize the fermentation processing. Results showed that the optimum volume ratio of juice was 50%, and optimum concentration of lysine and ascorbic acid was 0.22%, 0.21% respectively. The viable cell numbers of Bifidobacterium animalis 01 at optimal formula could reach up to (8.23±0.03) lg (CFU/mL), and maintained above 106CFU/ mL within 12 days storage at 4 ℃.

Bifidobacterium animal；Smallanthus sonchifolius；fermented beverage；response surface methodology

Q939.99

B

1002-6630(2010)18-0445-05

2010-06-23

國家“863”計劃項目(2008AA10Z324)；北京市自然科學基金項目(5072025)

王洋(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為益生菌與益生元的開發與利用。E-mail：chaosheng5@163.com

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為益生菌與益生元的開發與利用。E-mail：lipinglan420@126.com