高效毛細(xì)管電泳法測定胭脂蟲提取物中胭脂紅酸

李 坤，張 弘*，鄭 華，馬李一，趙 虹，郭元亨

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

高效毛細(xì)管電泳法測定胭脂蟲提取物中胭脂紅酸

李 坤，張 弘*，鄭 華，馬李一，趙 虹，郭元亨

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

建立高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)測定胭脂蟲提取物中胭脂紅酸含量的方法以含5%乙腈、5%乙二醇的40mmol/L Na2HPO4-Na2B4O7·10H2O混合緩沖液(pH9.434)為背景電解質(zhì)，60cm×75μm未涂層毛細(xì)管柱為分離泳道，分離電壓20kV，0.5psi×10s壓力進(jìn)樣，柱溫25℃，檢測波長239nm，此條件下，采用峰面積內(nèi)標(biāo)法定量；在選定的電泳條件下，胭脂紅酸質(zhì)量濃度在50～500mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9958，加標(biāo)回收率為100.86%，方法檢出限(RSN=3)為5.00μg/mL。本方法測定胭脂紅酸含量試劑用量少，簡便、快速、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于實際生產(chǎn)中胭脂紅酸的測定。

高效毛細(xì)管電泳；胭脂紅酸；測定含量

胭脂蟲(Dactylopius coccus Costa)原產(chǎn)于拉丁美洲，是一種寄生在仙人掌類植物上的經(jīng)濟性資源昆蟲，其雌成蟲干體可以提取一種珍貴的天然紅色素——胭脂蟲紅色素[1]。該色素主要成分為胭脂紅酸，又名洋紅酸，屬多羥基蒽醌類化合物。胭脂紅酸對于光、熱、微生物等有著良好的耐受性，尤其在酸性條件下可溶于熱水等溶劑，在一定pH值條件下能呈現(xiàn)黃、橙、紅、紫等多種艷麗色澤[2]。人類對胭脂紅酸的利用有著悠久的歷史，在古代人們就用它來做染料和口紅等，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人類對它性質(zhì)了解與開發(fā)的不斷深入，它已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝、醫(yī)藥等眾多行業(yè)[3-5]。

高效毛細(xì)管電泳法是近年來發(fā)展起來的一種高效分離分析技術(shù)，是經(jīng)典分離技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有高效、高靈敏度、進(jìn)樣少、低耗、快速、簡便等特點[6]。基于這些特點，現(xiàn)在它已越來越多地應(yīng)用于天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)和有效成分的分離與測定上[7]，并顯示出了較大的優(yōu)越性。對于胭脂紅酸分離檢測的方法，目前液相色譜法和分光光度法已見報道[8-10]，雖然國內(nèi)對于胭脂紅酸的高效毛細(xì)管電泳分離與檢測的方法也有報道，但大多都局限地應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的各類成型產(chǎn)品上[11]；對于以胭脂蟲為原料，采用現(xiàn)代提取工藝的胭脂紅酸提取物的分離與含量的毛細(xì)管電泳測定方法，國內(nèi)外還未見報道。本實驗采用高效毛細(xì)管電泳方法，用二極管陣列檢測器(DAD)，以肉桂

酸為內(nèi)標(biāo)，建立胭脂蟲天然提取物中胭脂紅酸含量的測定方法，取得滿意的效果，為實際生產(chǎn)中胭脂紅酸的分離與檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂蟲雌成蟲干體，引自拉丁美洲，由中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所滇中高原試驗站提供。

胭脂紅酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度≥96%) 日本三榮源食品工業(yè)株式會社；肉桂酸(分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純) 上海新華化工廠；硼砂(分析純) 廣東汕頭新寧化工廠；硼酸(分析純) 重慶川江化學(xué)試劑廠；碳酸鈉、無水乙醇(均為分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫鈉(分析純) 成都市金山化工試劑廠；檸檬酸(分析純)北京化工廠；檸檬酸納(分析純) 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；乙腈(分析純) 上海陸都化學(xué)試劑廠；乙二醇(分析純) 天津市化學(xué)試劑三廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Beckman P/ACETMsystem MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀美國貝克曼-庫爾特有限公司；熔融石英毛細(xì)管(60cm× 75μm) 河北永年光導(dǎo)纖維廠；PHS-3C精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AB204-S精密型電子天平Mettler Toledo中國有限公司；Prep/scale超濾系統(tǒng)、螺旋卷式再生纖維素膜(截留相對分子質(zhì)量3k和5k)、螺旋卷式聚醚砜膜(截留相對分子質(zhì)量10k和30k) 美國Millipore公司；SD1000型噴霧干燥儀 日本東京理化株式會社；Purelab Ultra 超純水系統(tǒng) 英國ELGA公司。

1.3 樣品前處理

稱取100g胭脂蟲干體，以水為溶劑進(jìn)行提取后收集濾液[12]，再經(jīng)噴霧干燥制得粉末備用，所有溶液進(jìn)樣前均用0.45μm纖維素膜過濾。

1.4 實驗條件

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液的配制

精密稱取胭脂紅酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1g溶于100mL容量瓶中，用超純水定容配制質(zhì)量濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；精密稱取肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1g溶于100mL容量瓶中，用乙醇定容配制質(zhì)量濃度為1mg/mL的內(nèi)標(biāo)物貯備液；分別移取內(nèi)標(biāo)物貯備液1mL和標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL于10mL容量瓶中，配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為0.1mg/mL、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

精密稱取1.3節(jié)中制取的胭脂蟲提取物樣品0.1g溶于100mL容量瓶中，再分別移取2、3、4、5、6mL于10mL容量瓶中，超純水定容，配制質(zhì)量濃度依次為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的胭脂紅酸樣品液備用。

1.4.2 電泳條件

采用未涂層石英毛細(xì)管60cm×75μm(有效長度50cm)，分離電壓20kV，分離時間20min，檢測波長239nm，柱溫25℃，0.5psi×10s壓力進(jìn)樣，含5%乙二醇和5%乙腈的40mmol/L磷酸氫二鈉-硼砂混合緩沖液，pH9.434。毛細(xì)管使用前依次用甲醇、水、0.1mol/L鹽酸、1mol/L氫氧化鈉、運行緩沖液沖洗2min，每兩次樣品運行之間，依次用水、0.1mol/L氫氧化鈉、水、電泳緩沖液沖洗5、3、3、5min。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 電泳緩沖液的組成和濃度

圖1 緩沖液中含5%乙腈和5%乙二醇時胭脂紅酸的電泳譜圖Fig.1 HPCE separation of carminic acid using a disodium hydrogen phosphate/borax buffer system containing 5% acetonitrile and 5% ethylene glycol

圖2 緩沖液中不含添加劑的胭脂紅酸的電泳譜圖Fig.2 HPCE separation of carminic acid using a pure disodium hydrogen phosphate/borax buffer

由于胭脂紅酸為多羥基的蒽醌類羧酸，其蒽醌母核上的羥基不僅具有弱酸性，在一定條件下還可以與緩沖液產(chǎn)生結(jié)合，故而緩沖液的組成和濃度對胭脂紅酸的分離有著顯著的影響，本實驗考察了不同濃度的磷酸鹽、硼砂、碳酸鹽、檸檬酸鹽及其混合緩沖體系對胭脂紅酸分離效果的影響，結(jié)果表明，以40mmol/L Na2HPO4-Na2B4O7·10H2O混合緩沖液為基礎(chǔ)電解質(zhì)時，胭脂紅酸保留時間較短，分離效果較好。此外，在選定背景電解質(zhì)的基礎(chǔ)上，還探索了SDS、β-環(huán)糊精、正丁醇，乙二醇，乙腈等添加劑對改善分離效果的影響，

如圖1、2所示。對比圖1、2不難看出，當(dāng)加入5%乙二醇和5%乙腈時，樣品分離度和拖尾現(xiàn)象均得到明顯的改善，所以最終選定含5%乙二醇和5%乙腈的40mmol/L磷酸氫二鈉-硼砂溶液作為緩沖體系。

2.1.2 緩沖液pH值的選擇

在胭脂紅酸的粗提樣品中，蛋白質(zhì)是主要的雜質(zhì)之一，也是貯藏時引起其變質(zhì)的最主要原因。由此可見，適當(dāng)?shù)膒H值的選擇對于分離其中的蛋白質(zhì)或氨基酸至關(guān)重要，因為它不僅影響胭脂紅酸的電離，同時對于調(diào)整蛋白質(zhì)和氨基酸的等電點，達(dá)到良好的分離效果有著重要的影響。由于胭脂紅酸母核上含有1個羧基和4個羥基，為使其較好的電離，應(yīng)該選擇中性或者堿性的緩沖液pH值。本實驗探討了pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.434、9.523、9.828、10.0、10.5、11.0的40mmol/L磷酸氫二鈉-硼砂緩沖液對分離效果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)pH9.434時分離效果最好，故選擇pH9.434的緩沖液作為運行介質(zhì)。

2.1.3 分離電壓的選擇

圖3 分離電壓≥20kV時的譜圖對比Fig.3 Comparison among capillary electropherograms of carminic acid at three different separation voltages of more than 20 kV

在選定的緩沖液類型和pH值的條件下，考察了分離電壓為10、15、18、20、23、25kV時對分離效果的影響。結(jié)果如圖3、4所示，當(dāng)分離電壓大于20kV時，隨著分離電壓的增大，盡管保留時間相對縮短，但由于電滲流的增強，導(dǎo)致峰形拖尾明顯，分離度降低；當(dāng)分離電壓小于20kV時，盡管峰形沒有明顯的差別，但保留時間延長。綜合上述因素，故而選擇20kV作為緩沖液分離電壓為宜。

圖4 分離電壓≤20kV時的譜圖對比Fig.4 Comparison among capillary electropherograms of carminic acid at three different separation voltages of less than 20 kV

2.1.4 檢測波長的選擇

以含5%乙二醇和5%乙腈的40mmol/L磷酸氫二鈉-硼砂混合緩沖體系為參比，對5×10-4mol/L的胭脂紅酸溶液進(jìn)行紫外及可見光區(qū)全波長掃描，如圖3所示，在紫外區(qū)239nm和302nm處有最大吸收，在可見光區(qū)534nm處有最大吸收，但肉桂酸醇溶液為無色，在可見光區(qū)并沒有吸收峰，所以選534nm檢測波長不合適；對比電泳譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇239nm作為檢測波長時基線穩(wěn)定、峰型較好，胭脂紅酸與肉桂酸均有較強吸收，故以239nm作為檢測波長。

圖5 以緩沖溶液為參比的胭脂紅酸紫外-可見光區(qū)吸光度掃描圖Fig.5 UV-visible scanning spectrum of carminic acid using a disodium hydrogen phosphate/borax buffer system containing 5% acetonitrile and 5% ethylene glycol as the reference

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖6 高效毛細(xì)管電泳法測定胭脂紅酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of carminic acid determined by HPCE

分別取1.4.1節(jié)所配制的胭脂紅酸質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.4.2節(jié)選定的條件進(jìn)樣。以胭脂紅酸和肉桂酸的峰面積比值為縱坐標(biāo)，胭脂紅酸濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=6.9275x+0.0625(R=0.9958)。

2.3 樣品中胭脂紅酸含量的測定

表1 胭脂紅酸含量的定量分析結(jié)果Table 1 Quantitative determination of carminic acid

表3 胭脂紅酸重現(xiàn)性的分析測定結(jié)果Table 3 Repeatability of determining carminic acid by HPCE

取1.4.1節(jié)中配制的胭脂紅酸質(zhì)量濃度依次為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的樣品液，按照1.4.2節(jié)的方法測定其在239nm條件下胭脂紅酸與肉桂酸峰面積，按2.2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算胭脂紅酸的含量，結(jié)果見表1。

2.4 穩(wěn)定性的測定

精確移取胭脂紅酸樣品液4mL和內(nèi)標(biāo)物貯備液1mL于10mL容量瓶中，超純水定容。按1.4.2節(jié)的方法分別測定0、2、4、6、8、10、12、24、36、48h胭脂紅酸與肉桂酸的峰面積，計算胭脂紅酸與肉桂酸的峰面積比，RSD為0.97%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 胭脂紅酸穩(wěn)定性的分析測定結(jié)果Table 2 Stability of determining carminic acid by HPCE

2.5 重現(xiàn)性的測定

取1.4.1節(jié)的的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液2.5mL和內(nèi)標(biāo)物貯備液1mL于10mL容量瓶中，用超純水定容。按照1.4.2節(jié)的方法分別進(jìn)樣11次，數(shù)據(jù)如表3所示，測得胭脂紅酸與肉桂酸的峰面積比值的RSD為2.04%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率

表4 不同濃度樣品液中胭脂紅酸的回收率Table 4 Average spike recovery rate of determining carminic acid by HPCE

取1.4.1節(jié)所配制的胭脂紅酸樣品貯備液1、2、3、4、5、6、7mL于10mL容量瓶中，并分別加入2mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液和1mL內(nèi)標(biāo)物貯備液，按照1.4.2節(jié)的方法進(jìn)樣，結(jié)果如表4所示。

3 結(jié) 論

3.1 建立了高效毛細(xì)管電泳測定胭脂蟲提取物中胭脂紅酸含量的方法，并對電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化：在239nm檢測波長、25℃柱溫、0.5psi×10s進(jìn)樣條件下，以含5%乙腈-5%乙二醇的40mmol/L Na2HPO4-Na2B4O7·10H2O混合緩沖液(pH9.434)為背景電解質(zhì)，60cm×75μm未涂層毛細(xì)管柱為分離泳道，實現(xiàn)了對胭脂蟲天然提取物中有效成分胭脂紅酸的直接有效地測定，方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，檢出限為5.00μg/mL，回收率達(dá)到100.86%。

3.2 在進(jìn)行胭脂紅酸等天然提取物的毛細(xì)管電泳分離測定時，由于提取物中所含雜質(zhì)的種類繁多、成分和含量大多未知，所以在選定背景電解質(zhì)的基礎(chǔ)上，應(yīng)多嘗試添加劑對分離效果的影響，往往能得到較好的效果。

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Determination of Carminic Acid Content in Cochineal Extract by High Performance Capillary Electrophoresis

LI Kun，ZHANG Hong*，ZHENG Hua，MA Li-yi，ZHAO Hong，GUO Yuan-heng
(Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects, State Forestry Administration, Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

A method for determining the content of carminic acid in cochineal extract was established using high performance capillary electrophoresis (HPCE). All experiments were carried out on an uncoated capillary column (60 cm × 75 μm, i.d.) under 20 kV and 0.5 psi × 10 s injection pressure at 25 ℃. The detection wavelength was set at 239 nm. Internal calibration method was used for quantification. Under all selected conditions, a good linear relationship of carminic acid was observed over the range of 50 to 500 mg/L, with a linear correlation coefficient of 0.9958. The average recovery rate of carminic acid in 7 parallel cochineal extracts spiked at a level was 100.86% and the detection limit was 5.00 μg/mL. This method is simple, rapid, accurate and can provide a reference for actual production.

high performance capillary electrophoresis (HPCE)：carminic acid；content determination

TS202.3；O657.8；S899.3

A

1002-6630(2010)18-0355-04

2010-06-22

國家林業(yè)科技成果推廣項目([2010]11)；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2010GB24320619)

李坤(1987—)，男，碩士研究生，主要從事天然資源化學(xué)與利用研究。E-mail：langyue1987@163.com

*通信作者：張弘(1963—)，男，研究員，學(xué)士，主要從事林業(yè)生物資源化學(xué)與利用研究。E-mail：kmzhhong@163.com