高效液相色譜法檢測豬肉中安眠酮殘留量

呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強，吳云普

(惠州出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，廣東 惠州 516006)

高效液相色譜法檢測豬肉中安眠酮殘留量

呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強，吳云普

(惠州出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，廣東 惠州 516006)

建立高效液相色譜法 (HPLC)檢測豬肉中安眠酮殘留量。經(jīng)過實驗確定用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動相定容后用高效液相色譜儀測定；采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相，226nm為測定波長，1.0mL/min的流速。在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關系，最低檢測限為0.020mg/kg，回收率在70%～110%之間，標準曲線回歸方程為Y=6.90×104X+3.71×103，相關系數(shù)為0.999。此法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理簡便易行，適用于測定豬肉中的安眠酮。

高效液相色譜法；豬肉；安眠酮；固相萃取

安眠酮(methaqualone)，又稱甲苯喹啉酮。分子式C16H14N2O，相對分子質量250.29。白色結晶粉末。無臭、微苦。熔點120℃。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等。有吸濕性、有鎮(zhèn)靜和催眠作用，適用于精神性失眠。

農(nóng)業(yè)部公布的《食用動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中有21類近40個品種的原料藥及其單方、復方制劑產(chǎn)品停止使用，其中安眠酮也位列其中。安眠酮系喹唑酮類衍生物，臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥[1]，主要用于動物過度興奮或驚厥，可使機體平靜。但該藥副作用較大，消費者誤食了含有安眠酮的豬肉，會表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈、無力、四肢及口舌麻木，個別較重患者有短時間的精神失常。過量中毒可出現(xiàn)昏迷、視神經(jīng)乳頭水腫、心跳過速、呼吸抑制等癥狀。久吃含有此藥的肉類，人體可產(chǎn)生耐藥性。近年來，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些不法分子在經(jīng)濟利益的驅動下，置法律法規(guī)于不顧，擅自在畜禽飼養(yǎng)中添加使用，從而嚴重影響人們的身體健康。目前，在國內(nèi)動物源性食品中安眠酮殘留量的檢測還沒有相關的檢驗標準[2-3]。本實驗采用二氯甲烷提取，用高效液相色譜儀檢測，建立動物源性食品中安眠酮殘留量的測定方法，以期為動物源性食品的質量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉 惠州東進肉聯(lián)廠。

安眠酮標準品(純度＞99.0%，質量濃度10.000mg/L)；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷(均為色譜純)德國Meker公司；乙腈飽和正己烷(色譜純)；乙酸胺、氫氧化鈉、無水硫酸鈉(均為分析純)；凈化用洗脫液：

乙腈+丙酮(體積比1:1)。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(帶2487紫外-可見波長檢測器或2998二極管陣列檢測器)、Empower 2 工作站、固相萃取裝置、HLB C18SPE(3cc，60mg) 美國Waters公司；717Plus 自動進樣器 德祥科技有限公司；3-18K型離心機 Sigma公司；R-210型旋轉蒸發(fā)儀 Buchi公司；濾膜、快速定性濾紙。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精確移取安眠酮標準品1.000mL，用乙腈稀釋并定容至10mL，搖勻，制備成質量濃度為1.000mg/L的標準儲備液。精確吸取標準儲備液2.0、5.0、10、20mL分別置于100mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，使質量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20mg/L的標準使用液，使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以外標法定量。

1.3.2 色譜分離條件

色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)；測定波長為226nm；流動相為乙腈:乙酸胺 (25mmol/L)=40: 60(V/V)；流速1.0mL/min；進樣量20μL；柱溫40℃。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 提取

稱取5.0g(精確到0.01g)組織樣品和10g無水硫酸鈉于50mL離心管中，加入1mL 1mol/L NaOH溶液和20mL二氯甲烷，均質提取1min，4000r/min離心5min，上清液經(jīng)快速定性濾紙過濾到100mL濃縮瓶中，殘渣用20mL二氯甲烷超聲提取10min，4000r/min離心5min，合并二氯甲烷，40℃旋轉蒸發(fā)至干。

1.3.3.2 凈化

殘留物中加入1mL流動相，充分旋渦振蕩，轉移至5mL離心管中，加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，棄去上層正己烷層，原離心管中再加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，下層加0.1mol/L的NaOH溶液稀釋至5mL，作為待凈化液以備用。用3mL甲醇，3mL 0.1mol/L的NaOH以1mL/min的流速淋洗活化萃取柱，然后將5mL待凈化液通過柱子(控制流速小于0.5mL/min)，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液，3mL甲醇以1mL/min的流速過柱洗雜，最后用5mL乙腈-丙酮(體積比1:1)洗脫(控制流速小于0.5mL/min)，收集洗脫液于25mL濃縮瓶中，40℃旋轉蒸發(fā)至干，加1mL流動相溶解殘渣，溶液過0.45μm有機相濾膜后上高效液相色譜儀測定。

1.3.4 樣品測定

取供上機檢測的樣品溶液20μL，注入高效液相色譜儀。根據(jù)樣液中安眠酮含量的情況，選取相應值相近的標準工作溶液，標準工作溶液和待測樣液中安眠酮含量的相應值均應在儀器的線性范圍內(nèi)，對標準工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。與標準的保留時間比較定性，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 樣品的預處理

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于安眠酮易溶于乙醇、乙醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿5種試劑做回收率比對實驗，回收率分別為70.1%、82.5%、83.7%、91.4%、89.8%。二氯甲烷的回收率最高，所以用二氯甲烷作提取液。

2.1.2 樣品溶液pH值的調節(jié)[4]

安眠酮在弱堿性條件下更易溶于有機溶劑，考慮在提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，調節(jié)pH值在8～9之間。分別做回收率比對實驗，回收率為87.5% (pH8～9)和80.3%(未調pH值)，所以選擇在樣品提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，控制pH值在8～9之間。

2.1.3 凈化時殘渣溶解液的選擇

選用二氯甲烷、乙腈及流動相溶解殘留物。用二氯甲烷溶解時與正己烷互溶，嚴重的影響樣品的回收，不予考慮；用乙腈溶解時，雜質干擾峰較多，綜合考慮采用流動相溶解效果最好。

2.1.4 萃取柱凈化[5-7]

由于動物肌肉中通常含有脂肪，首先需要脫脂步驟，在提取溶劑中加入正己烷，去除脂類雜質。若基質比較干凈，則可直接裝瓶上機；若干擾峰較多，則要進行固相萃取柱萃取。對OasisHLB、MCX、MAX不同極性的萃取柱進行方法實驗，結果表明：OasisHLB得到的回收率較高且穩(wěn)定，通過上柱條件，淋洗，洗脫各條件實驗，最終確定的固相萃取條件如下：樣液轉移至已預先用3mL甲醇活化、3mL 0.1mol/L NaOH溶液平衡的OasisHLB固相萃取柱中，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用洗脫液洗脫。實驗表明，采用OasisHLB固相萃取柱處理樣品除雜質效果好，分析物有高回收率、重現(xiàn)性好。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇[8-9]

在所有條件相同的情況下，進相同質量濃度的標準溶液。比較甲醇-水和乙腈-乙酸胺(25mmol/L)這兩種流動相，分別取甲醇-水體積比為40:60、50:50、30:70，此流動相在這3個比例的條件下均未出峰；乙腈-乙酸胺(25mmol/L)的體積比為30:70、45:55、40:60、75:25、

90:10、15:85，比較峰面積(圖1)，表明適合以乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相。2.2.2檢測波長的選擇

圖1 流動相比例與峰面積對應關系柱形圖Fig.1 Relationship between mobile phase composition and peak area of methaqualone

在 200～400nm 范圍內(nèi)對安眠酮標準溶液進行掃描，安眠酮在 206、226、266、306、318nm 處有 5 個依次變低的吸收峰。參照文獻[8]最終確定檢測波長為226nm。2.2.3色譜條件的確定[10]

考慮到Sunfire C18色譜柱針對堿性化合物能有效地改善分離度，在低和中等pH值流動相條件下，對酸性、中性和堿性化合物都有杰出的柱效。且實驗表明分離效果理想。在目標峰附近無干擾峰。經(jīng)實驗采用的色譜條件為：色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)、柱溫為40℃、流動相為乙腈-乙酸胺(25mmol/L)溶液(40:60，V/V)，流速為1.0mL/min，檢測器為紫外檢測器或二極管陣列檢測器，檢測波長為226nm，進樣量為20μL，安眠酮的保留時間約為8min左右，所得色譜峰峰形較好，并且實現(xiàn)了安眠酮與雜質的良好分離。2.3標準色譜圖和樣品加標色譜圖

3 結 論

圖2 安眠酮標準品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of methaqualone standard

圖3 加標樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of a spiked sample

按照2.2.3節(jié)條件進行色譜分析得到安眠酮的色譜圖，圖2為安眠酮的標準色譜圖，出峰時間在7.5min左右；圖3為豬肉樣0.020mg/kg標品添加量回收色譜圖。

2.4 方法的線性關系

安眠酮在0.02～0.20mg/L內(nèi)線性關系顯著。以峰面積-質量濃度作圖，得到標準曲線回歸方程為Y=6.90× 104X+3.71×103，相關系數(shù)為0.999。

2.5 最低檢測限

在RSN=3條件下確定安眠酮最低檢測限為0.020mg/kg。

2.6 方法的加標回收率

表1 樣品加標平均回收率(n=6)Table 1 Inter-and intra-laboratory average recovery rates of methaqualone (n=6)

由表1可見，在添加量在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)，回收率在70%～110%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，回收效果較好。

本實驗旨在建立安眠酮的高效液相色譜檢測方法。用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動相定容后用高效液相色譜儀測定。采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相，226nm為測定波長，1.0mL/min的流速色譜分析條件，可以實現(xiàn)動物組織中安眠酮的檢測。此法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理簡便易行，適用于測定豬肉中的安眠酮。

[1]郭幼梅, 諸秋珉, 姜宴. 用HPLC法同時檢測生物檢材中安眠酮及其2-羥甲基代謝物[J]. 上海醫(yī)科大學學報, 1996, 23(1): 43-45.

[2]員克明, 李貴明, 王英元, 等. 安眠酮薄層色譜掃描檢測研究[J]. 中國法醫(yī)學雜志, 1997, 12(1): 25-26.

[3]宋鳳瑞, 劉淑瑩. 安眠鎮(zhèn)靜藥物的串聯(lián)質譜分析方法[J]. 分析化學, 1998, 26(11): 1394-1396.

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Determination of Methaqualone Residues in Pork by High Performance Liquid Chromatography

(Center of Comprehensive Technology, Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huizhou 516006, China)

A high performance liquid chromatographic method was established to determine the content of methaqualone residues in pork. Sample extraction was carried out using dichloromethane as the extraction solvent, followed by clean-up on a solid-phase extraction column and dillution to a certain volum with the mobile phase composed of acetonitrile and 25 mmol/L ammonium acetate before injection onto HPLC system. The detection wavelength was 226 nm and the mobile phase flow rate was 1.0 mL/min. The calibration curve of the developed method was as follows: Y = 6.90 × 104X +3.71 × 103, with a correlation coefficient of 0.999, which exhibited good linearity over the concentration range from 0.020 to 0.20 mg/kg. The detection limit was 0.020 mg/kg, and the inter- and intra-laboratory average spike recovery rates of methaqualone at three levels were between 70% and 110%. This method has the benefits of simplicity, rapidity, high sensitivity, convenience and good feasibility and most suitable for the determination of methaqualone residues in pork.

high performance liquid chromatography；pork；methaqualone；SPE

TS207.3；R155.5

A

1002-6630(2010)18-0295-03

2009-12-16

呂飛(1978—)，女，工程師，在職碩士研究生，主要從事食品檢驗研究。E-mail：lvfei1026@163.com