微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚

徐國前，張振文,2,*，郭安鵲,2，房玉林,2，欒麗英

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚

徐國前1，張振文1,2,*，郭安鵲1,2，房玉林1,2，欒麗英1

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

基于Folin-Ciocalteu分光光度法的原理，借助微量移液器和微波處理，通過優化反應條件，建立一種新的微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的方法。實驗得到體系的最佳反應條件為0.1mL測試樣品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波爐的中檔下處理20s后測定765nm波長處的吸光度。以沒食子酸為標準品作標準曲線，在質量濃度1～50mg/L范圍內與吸光度呈良好線性關系(R2=0.9996)。對葡萄皮與葡萄酒進行加標回收率實驗的平均回收率分別為98.1%和97.2%，精密度(n=9)測定相對標準偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%。該方法不但量微、快速，而且操作簡便，重復性好，結果精準可靠。

葡萄；葡萄酒；總酚；測定；Folin-Ciocalteu法

多酚是植物中一類重要的次生代謝物，它們除賦予植物葉片、花瓣和果實不同顏色外，在植物生理生化上，具有吸收紫外線和自由基而起到保護細胞的生理作用，也作為植物抗毒素抵抗微生物和真菌的浸染[1-2]，阻止食草動物取食等。多酚也是葡萄酒的重要成分，構成了葡萄酒特有的感官特征；因其可以消除人體內的自由基而起到抗氧化、抗腫瘤、抗癌、降血脂、預防動脈粥樣硬化和冠心病等保健作用[3-5]。因此在控制葡萄酒質量時，必須檢測總酚含量。

目前，定量分析葡萄與葡萄酒總酚的方法主要有氧化滴定法、色譜分析法和分光光度法3類[6]，每類中又有不同的具體方法，也有各自的優缺點。相比較而言，Folin-Ciocalteu分光光度法價格低、操作方便，且測定不同生物原料中的總酚準確，所以是定量分析總酚的普遍方法，這也是美國官方分析化學師協會(AOAC)定量分析葡萄酒或蒸餾酒精內丹寧的方法[7]。但是，Folin-Ciocalteu法受當時條件所限[8]，測定過程冗長費時，所耗試劑和標準物質量大，標準曲線制作和測試過程也非常繁雜。后來Bajaj等[9]和Ainsworth等[10]進行減少反應體積改良實驗，van Alstyne[11]和田文禮等[12]則是通過升

高溫度加速反應來縮短時間；但如果通過加熱樣品來加速反應，又易使顏色分解較快，結果相當不穩定[13]，且試劑和標準物質用量仍然相對較多，仍較耗時。隨著微量移液器的廣泛使用，使得精確量取微量液體成為現實；同時微波已作為輔助手段在化學和生物樣品的準備等領域得到了廣泛的應用[14]。

本實驗基于Folin-Ciocalteu分光光度法原理，借助微量移液器和微波輻射處理，優化反應條件，建立一種新的微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄(戶太8號) 西安市葡萄研究所；干紅葡萄酒(2008) 王朝葡萄釀酒有限公司。

鎢酸鈉、鉬酸鈉和硫酸鋰(均為分析純) 國藥集團上海化學試劑公司；濃磷酸、濃鹽酸和無水Na2CO3(均為分析純) 西安化學試劑廠；沒食子酸(分析純) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外分光光度計 日本島津公司；KQ-300DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WP700(21)型微波爐 格蘭仕電器有限公司；移液器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

Folin-Ciocalteu試劑：按文獻[15]方法配制，得到2mol/L的試劑，用時稀釋1倍。

Na2CO3溶液：稱取200.00g無水Na2CO3，溶于950mL沸水中，冷卻至室溫后定容至1000mL，24h后過濾得到200g/L溶液，用時分別稀釋至不同質量濃度。

50.0mg/L標準溶液：稱取沒食子酸5.0mg溶解于8.0mL的甲醇中，并用水定容至100mL(現用現配，冷藏時間不能超過2周)。

1.3.2 總酚的提取

稱取40℃烘干的葡萄皮0.050g，用5.0mL 體積分數為80%的甲醇溶液(含0.012mol/L鹽酸)在40℃，40kHz超聲波提取40min后，在8500r/min 4℃離心15min，提取2次，合并提取液，定容到10.0mL，然后取1.0mL用雙蒸水稀釋至10.0mL測定。

葡萄酒直接吸取1.0mL于100mL容量瓶中加8.0mL甲醇后定容測定。

1.3.3 微波處理的優化實驗

在聚苯乙烯離心管內加入0.1mL 30.0mg/L的標準溶液和0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻后，在1～8min內加入0.8mL不同質量濃度的Na2CO3溶液(20、30、40、50、60g/L)。然后放入盛有100mL室溫水的塑料杯內，且置于微波爐中心，在微波爐的中低檔和中檔下分別微波輻射處理10、20、30、40s后測765nm波長處的吸光度，以確定最佳的Na2CO3質量濃度、微波輻射功率和時間；另外把放入35℃水中作對照(100.0mL水在中低檔處理30s時，水溫達35℃)。

1.4 數據統計分析

各數據重復4次，采用數據統計軟件DPS(Data Processing System) v7.05版對試驗所得結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 反應條件的優化

圖1 不同質量濃度Na2CO3在不同輻射功率和時間的吸光度變化Fig.1 Absorbance of Na2CO3 with various concentrations at different irradiation power and time

從圖1可以看出，當功率和處理時間相同時，Na2CO3溶液質量濃度高的吸光度大；當Na2CO3溶液質量濃度相同，除60g/L的Na2CO3溶液在中檔輻射20s，吸光度達到最大值后開始下降外，其他在同檔情況下，都是隨著輻射處理時間延長，吸光度在逐漸增大；在Na2CO3溶液質量濃度和處理時間相同時，中檔處理的吸光度均比中低檔的大。統計結果分析表明：50g/L和60g/L Na2CO3溶液的處理中，除對照和中低檔輻射10s處理和其他的差異極顯著外，同質量濃度之間差異不顯著(P＜0.01)；20、30、40g/L Na2CO3溶液處理之間變化則較大。這和Akins等[14]測試蛋白質時得到的結果相似。因此，下面采用60g/L的Na2CO3溶液中檔輻射20s作為反應條件。

Folin-Ciocalteu法測定總酚的原理是：Folin-Ciocalteu試劑在弱堿性條件下被酚還原產生復雜的藍色混合物，該藍色物質在765nm處有最大吸收峰[8]。且吸光度與總酚的含量在一定濃度范圍內呈線性關系。但該反應的Folin-Ciocalteu試劑和形成的藍色產物在堿性或高溫下都易分解，而酚又要求在堿性條件下才能反應。所以升高溫度雖可以加速反應，達到最大吸光度的時間也變短，但表現不穩定；堿性過強也促進分解。所以在

常規Folin-Ciocalteu法測總酚時溫度不宜超過30℃，Na2CO3的質量濃度一般不超過50g/L[16-18]。在微波輻射處理下，因反應極快，時間特短，Folin-Ciocalteu試劑和藍色素雖在高堿性條件下，但分解較少。

微波加速反應是種非熱效應，與微波的高頻電磁波特征相關。微波爐輻射也可以提高水溫，但這種急劇的加速變化與溫度變化是獨立的，同時觀察到在同樣溫度下對照處理和微波爐輻射處理之間差異極顯著。所以微波爐加熱這種基本方式不是反應加速的主要原因。因此推測，當微波通過測試液時，加速了測試液內分子間的碰撞和摩擦，促進試劑的化學擴散，并增強了結合，這樣微波輻射極大加速了測定總酚時反應速度。另外，系統中水分子在連續高速變化的電磁場下高速旋轉，分子間作用力可能發生一些特殊變化，例如溶劑自身分子之間、溶質與溶劑分子之間、酚分子之間不能形成氫鍵，這樣離子化分子增多，便于快速反應。

2.2 方法評價

2.2.1 標準曲線的制作和精密度測定

準確吸取50.0mg/L的沒食子酸標準溶液0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.10mL分別于6支(1～6號)5mL離心管中，然后以體積分數為8%的甲醇溶液補到0.1mL；如測試樣品時，取0.1mL樣品。加入0.1mL Folin-Ciocalteu試劑后充分振蕩，在1～8min內分別加入0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，搖勻放入內有100mL室溫水的塑料杯內，且置于微波爐中心，在中檔下處理20s。1號試管溶液為空白調零，測765nm波長處的吸光度，以吸光度對質量濃度進行回歸，得標準曲線回歸方程Y=0.0108X－0.0021(R2= 0.9996)，線性范圍1～50mg/L。

對稀釋后的葡萄皮提取液和葡萄酒樣各進行9次平行測定，結果葡萄皮和葡萄酒總酚含量分別為18.53mg/g和2500mg/L，相對標準偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%，說明該方法具有較好的精密度。

2.2.2 加標回收率實驗

表1 加標回收率實驗Table 1 Recovery experiments for spiked samples

依據2.2.1節的結果，準確吸取稀釋后葡萄皮提取液和葡萄酒樣，分別按其總酚含量的80%、100%和120%添加沒食子酸標準溶液(n=3)，測定各樣品的總酚含量，并計算回收率。加樣的結果見表1。

由表1可見，此方法測定葡萄皮和葡萄酒總酚的加樣回收率分別是98.1%和97.2%，具有較好的回收效果。

3 結 論

本研究在傳統的Folin-Ciocalteu分光光度法的原理基礎上，首次用微波處理，極大的縮短了反應時間。通過優化反應條件，簡化測試程序，得到體系的最佳反應條件為0.1mL樣品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波爐的中檔條件下處理20s后，測定765nm波長處的吸光度。以低質量濃度沒食子酸(50mg/L)為標準樣品直接作標準曲線，質量濃度在1～50mg/L范圍內與吸光度呈良好線性關系(R2=0.9996)。利用該法測定添加沒食子酸標準樣的葡萄與葡萄酒樣，平均回收率分別為98.1%和97.2%，相對標準偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%。本法是一種簡單、微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的新方法。微波爐加速反應的機制仍需要進一步的研究。

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Rapid and Micro-Determination of Total Polyphenol in Grape and Grape Wine

XU Guo-qian1，ZHANG Zhen-wen1,2,*，GUO An-que1,2，FANG Yu-lin1,2，LUAN Li-ying1
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Research Center for Viti-viniculture of Shaanxi Province, Yangling 712100, China)

Based on the principle of Folin-Ciocalteu (F-C) assay for determining total polyphenol in grape and grape wine, a new method was developed by optimizing reactive conditions with the aid of micropipette and microwave irradiation. The optimal conditions were 0.1 mL of sample, 0.1 mL of 1 mol/L F-C reagent and 0.8 mL of 60 g/L Na2CO3, microwave treatment for 20 s at the middle power level, determination wavelength of 765 nm. The standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and gallic acid concentration from 1 to 50 mg/L (R2= 0.9996). When several gallic acid solutions were added to grape and grape wine samples, the average recovery rates of spiked gallic acid in grape and grape wine samples were 98.1% and 97.2%, respectively, with a relative standard deviation (RSD) ranging from 1.40% to 1.01%. This new method is characteristic of simple operation, fast determination, excellent precision, prefect reproducibility and significant reduction in the consumption of samples, reagents as well as time. Therefore, this new method is a promising method for determining total polyphenol in grape and grape wine.

grape；grape wine；total polyphenol；determination；Folin-Ciocalteu assay

TS262.6；Q657.3

A

1002-6630(2010)18-0268-03

2009-12-14

國家現代農業產業技術體系建設專項(nycytx-30-zp-04)

徐國前(1968—)，男，博士研究生，研究方向為葡萄栽培與釀酒。E-mail：xugql@163.com

*通信作者：張振文(1960—)，男，教授，碩士，研究方向為葡萄栽培與釀酒。E-mail：Zhangzhw60@nwsuaf.edu.cn