復合酶法提取紅蘑多糖工藝

李書倩，張 博，辛 廣，于 洋，劉長江*

(1.鞍山師范學院化學系，遼寧 鞍山 114007；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

復合酶法提取紅蘑多糖工藝

李書倩1,2，張 博1，辛 廣1，于 洋1，劉長江2,*

(1.鞍山師范學院化學系，遼寧 鞍山 114007；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

以野生紅蘑為原料，復合酶法浸提紅蘑中真菌多糖。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計獲得最佳多糖提取工藝，即酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例為3:1(m/m)、pH5.0、酶解3h，此條件下提取多糖得率為12.0%。與傳統(tǒng)方法相比，該工藝具有提取條件溫和，提取時間較短，對多糖損傷小等特點。

紅蘑；多糖；提取；復合酶

紅蘑(Gomphidius rutilus)，學名血紅鉚釘菇，具有較高的食用和藥用價值，無任何毒性，其藥用價值主要體現(xiàn)在真菌多糖的生物活性上，尚未實現(xiàn)人工培育[1]。真菌多糖在國際上被稱為“生物反應調(diào)節(jié)劑”[2]，它能控制細胞分裂分化，調(diào)節(jié)細胞生長衰老[3]，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒[4]、促進核酸和蛋白質(zhì)的生物合成、修復損傷的組織細胞等多種功效，極具醫(yī)療和食用價值[5-6]，在生物學、醫(yī)學、藥物學、食品科學等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。因而，如何能從紅蘑中最大限度地提取多糖，且不破壞多糖的生物活性，對保持細胞健康，延長細胞壽命，從而實現(xiàn)人體健康有重要的意義[7-8]。

食用菌多糖的提取工藝近年來研究很多，但有關(guān)紅蘑多糖的提取工藝的研究還未見報道[9]。傳統(tǒng)工藝有熱水浸提法、酸提法、堿提法等，新興工藝包括酶提法、超聲波輔助法、微波輔助浸提法等[10]。其中熱水浸提法是最為經(jīng)典的方法，以工藝簡單，易于推廣等特點為人們所接受，但其提取率較低[11-12]；酸提和堿提都易破壞真菌多糖的生物活性[13]；超聲波輔助法和微波輔助浸提法都只是一種輔助的提取方法[14]。相對而言，酶法的提取工藝比較溫和[15]。因此，本研究通過采用復合酶法破壁，對野生紅蘑中粗多糖提取工藝進行優(yōu)化，從而得出最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生紅蘑 市購，烘干、粉碎過40目篩備用。

纖維素酶(酶活力1.0×106～2.0×106U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力1.0×105～2.0×106U/g)為生化試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無水乙醇、氫氧化鈉、丙酮、苯酚、石油醚、濃硫酸、濃鹽酸(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DZF型真空干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DELTA320pH酸度劑、PL2002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅磨多糖提取工藝[14-15]

工藝流程：野生紅蘑→烘干至質(zhì)量恒定→粉碎→稱量→酶解→滅酶→減壓抽濾→濃縮→濾液醇析→減壓抽濾→沉淀物→洗滌→烘干→粗多糖制品。

操作要點：稱取2g紅蘑干粉，按1:40(g/mL)的料液比加入蒸餾水，加入體積分數(shù)0.3%的復合酶液在一定溫度和pH值下酶解一定時間，升溫滅酶1.5h，進行減壓抽濾，得到的濾液減壓濃縮至1/3體積，加入3倍體積的無水乙醇，靜置24h，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌多糖除去部分的脂肪和蛋白質(zhì)，50℃條件下干燥多糖，稱量。

1.3.2 多糖測定

用干重法計算粗多糖的質(zhì)量，用苯酚-硫酸法檢測多糖含量確定多糖純度[16-18]。

1.3.3 多糖提取的單因素試驗[19]

紅蘑中的多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合于細胞中，用纖維素酶處理可以破碎細胞的細胞壁，木瓜蛋白酶可以破壞多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合力，使多糖易于從細胞中釋放出來。選取復合酶比例按質(zhì)量比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、酶解溫度(50、55、60、65℃)、酶解時間(1、2、3、4h)及pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)這4個因素考察各因素對紅蘑多糖得率的影響。

1.3.4 多糖提取的正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上進行正交試驗L9(34)設(shè)計，優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用極差法進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 復合酶比例對多糖得率的影響

分別驗證纖維素酶和木瓜蛋白酶的最適質(zhì)量分數(shù)，其結(jié)果均為0.3%，故設(shè)定復合酶的質(zhì)量分數(shù)為0.3%。改變纖維素酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量配比，即4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，在60℃，正常pH值條件下，酶解2h，測定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖1。

圖1 復合酶比例對多糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulase/papain mass ratio on polysaccharide yield

由圖1可知，多糖的得率取決于纖維素酶的含量，纖維素酶含量下降，則粗多糖的得率也隨之下降，這可能是由于纖維素酶含量下降，酶與底物接觸機會減少，破壁效果減弱，不利于多糖從細胞中釋放出來。而木瓜蛋白酶主要使多糖與結(jié)合的蛋白分開，提高多糖的得率，但與蛋白結(jié)合的多糖未從細胞中溶出，則不利于木瓜蛋白酶作用的發(fā)揮。如果繼續(xù)增加纖維素比例(4:1)，則多糖得率增加不明顯，考慮成本等因素，選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶比例3:1、2:1、1:1進行正交試驗設(shè)計。

2.1.2 復合酶溫度對多糖得率的影響

分別驗證纖維素酶和木瓜蛋白酶的有效溫度，試驗表明，纖維素酶的有效溫度為45～65℃，木瓜蛋白酶的有效溫度為50～90℃，故選取復合酶的溫度為50～65℃，即在纖維素酶與木瓜蛋白酶比例為3:1，正常pH值，復合酶溫度為50、55、60、65℃的條件下酶解2h，測定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖2。

圖2 復合酶溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on polysaccharide yield

由圖2可知，隨著溫度的升高，粗多糖的得率不斷增高，當溫度升高到60℃后，溫度的升高反而會降

低粗多糖的得率。這是因為溫度升高，反應物的能量增大，使反應速率加快，超過其最適溫度后，酶活減弱，所以反應速度會隨著溫度的升高迅速下降，故選擇作用溫度50、55、60℃進行正交試驗設(shè)計。

2.1.3 酶解時間對多糖提取率的影響

其他條件不變，分別采用1、2、3、4h提取紅蘑多糖，測定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，粗多糖得率也不斷上升，但時間達到3h后粗多糖的得率會隨著時間的延長而下降，這可能是因為酶解時間過長，會導致部分多糖結(jié)構(gòu)破壞，使粗多糖的得率下降。因此在3h周圍選擇作用溫度2.5、3、3.5h進行正交試驗設(shè)計。

2.1.4 復合酶最適pH值的確定

其他反應條件不變，分別在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液中進行反應，以pH值為橫坐標，粗多糖得率為縱坐標作圖，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖4。

圖4 復合酶pH值對多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on polysaccharide yield

由圖4可知，復合酶的最適pH區(qū)間為4.0～6.0，以5.0為最好，這是因為pH值可改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團的解離。在最適pH值時，酶分子上活性基團的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合。pH值高于或低于最適pH值時，活性基團的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結(jié)合力降低，因而酶反應速度降低。因此，在pH5.0周圍選擇pH4.5、5.0、5.5進行正交試驗設(shè)計。

2.2 正交試驗

2.2.1 試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，優(yōu)化提取工藝。選擇酶解時間、酶解溫度、纖維素酶與木瓜蛋白酶的比例和pH值4個對多糖提取影響較大的因素，設(shè)計L9(34)的正交試驗，因素水平編碼如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2.2.2 試驗結(jié)果與分析

L9(34)正交試驗結(jié)果如表2如示，通過極差分析，復合酶法提取紅蘑中的粗多糖最優(yōu)條件預測為A2B3C1D2，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為3:1、pH5.0。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

2.2.3 驗證實驗

表3 最佳工藝驗證實驗Table 3 Verification of optimal extraction conditions

采用優(yōu)化工藝提取紅蘑多糖，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例為3:1、pH5.0

的條件下進行驗證實驗，結(jié)果見表3，粗多糖得率為12.0%，比正交試驗中各處理的結(jié)果都高，證明正交試驗優(yōu)化結(jié)果有效。采用苯酚-硫酸法測定粗多糖中多糖含量，得其純度為78.17%。

3 討論與結(jié)論

為了保證多糖提取率，同時避免樣品處理間的環(huán)境誤差，采用1:40(g/mL)的料液比提取紅蘑中的多糖，但對于提取液進行濃縮時會耗時耗能，所以在進行后續(xù)的中試時還需進一步優(yōu)化料液比，以期提高工業(yè)生產(chǎn)效率。采用纖維素酶與蛋白酶提取紅蘑多糖，在提取過程中不可避免的增加紅蘑中蛋白質(zhì)的總含量，但在后續(xù)的多糖分離與純化的過程中將采用Sevag法去除粗多糖中的總蛋白，因此酶對于蛋白總量的影響可以忽略不計。

本研究采用單因素與正交試驗相結(jié)合，優(yōu)化復合酶法提取紅蘑中的粗多糖工藝，其最優(yōu)提取條件為A2B3C1D2，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例3:1(m/m)、pH5.0，粗多糖得率可達12.0%。與此前進行的經(jīng)典水提法相比(熱水浸提紅蘑多糖得率為8%)，得率有了較大的提高，且具備提取條件溫和，提取時間有所縮短，對多糖損傷小等特點，為紅蘑人工培育成功后的多糖利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

[1]上海農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所. 中國食用菌志[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1991: 97-98.

Double-enzyme Method for Polysaccharides Extraction from Gomphidius rutilus Fruitbodies

LI Shu-qian1,2，ZHANG Bo1，XIN Guang1，YU Yang1，LIU Chang-jiang2,*
(1. Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China；2. College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

For polysaccharide extraction, wild Gomphidius rutilus fruit bodies were hydrolyzed with cellulase and papain together. Based on single factor investigations, orthogonal array design was employed to optimize the hydrolysis process, and the optimum hydrolysis conditions were found as follows: hydrolysis temperature 60 ℃; cellulase/papain mass ratio 3:1; pH 5.0; and hydrolysis duration 3 h and the polysaccharide yield obtained under such conditions was 12.0%. This method has many advantages over conventional methods, such as gentle reaction conditions, time saving and less destructive effect on polysaccharide structure.

Gomphidius rutilus；polysaccharide；extraction；compound enzymes

TS201.22

A

1002-6630(2010)18-0143-04

2010-06-07

鞍山科技計劃項目(08SF24)

李書倩(1975—)，女，博士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：susanli52@163.com

*通信作者：劉長江(1955—)，男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：liucj597@sohu.com