紫外線輻照對(duì)馬鈴薯莖段愈傷組織及其再生植株的影響

陳愛(ài)芹，艾辛

（1.山西臨汾市汾西縣植保站，031500；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院）

紫外線輻照對(duì)馬鈴薯莖段愈傷組織及其再生植株的影響

陳愛(ài)芹1，艾辛2

（1.山西臨汾市汾西縣植保站，031500；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院）

用紫外線和低溫處理馬鈴薯試管苗莖段，然后觀察其再生過(guò)程，記載試管苗的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)形態(tài)等及棚栽苗和扦插苗的生長(zhǎng)特點(diǎn)并測(cè)定其生理指標(biāo)，研究紫外線和4℃低溫對(duì)大西洋馬鈴薯莖段組織的影響。結(jié)果表明，紫外線和4℃低溫能夠滲入生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞；顯著降低愈傷組織的生長(zhǎng)勢(shì)，誘導(dǎo)再生植株及其組織器官發(fā)生變異；證實(shí)紫外線照射4 min以上或紫外線照射3 min+4℃處理1個(gè)月對(duì)馬鈴薯具有明顯的誘變效應(yīng)。

大西洋馬鈴薯；莖段；紫外線；物理誘變

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）屬茄科茄屬雙子葉一年生草本塊莖植物，是重要的糧菜兼用作物和工業(yè)原料。在南方早春，時(shí)常會(huì)發(fā)生倒春寒天氣，而此時(shí)冬閑田種植的馬鈴薯正進(jìn)入地上部快速生長(zhǎng)期，倒春寒會(huì)使幼苗受到不同程度的凍害，影響馬鈴薯的生長(zhǎng)，從而降低后期馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。在我國(guó)北方倒春寒同樣使正值出苗期的馬鈴薯遭受嚴(yán)重凍害，為此亟待培育一些抗寒性強(qiáng)的馬鈴薯品種。本研究通過(guò)紫外線或紫外線+低溫處理馬鈴薯的莖段愈傷組織，探討其對(duì)馬鈴薯誘變的效果，以期為今后馬鈴薯育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯課題組提供的馬鈴薯品種大西洋的脫毒試管苗。試驗(yàn)于2006年10月至2008年4月分別在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室和園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

試管苗擴(kuò)繁：將試管苗切成約1 cm長(zhǎng)、帶有1～2個(gè)腋芽的莖段，在廣口瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)擴(kuò)繁，繼代3次，待試管苗擴(kuò)繁至約600株，苗長(zhǎng)至6～8片葉時(shí)切取莖段用于誘變處理。試管苗擴(kuò)繁條件：培養(yǎng)基為MS+3%食用白糖+0.7%瓊脂，pH值5.8，培養(yǎng)溫度25℃，光照14 h/d，光強(qiáng)2 000 lx，繼代時(shí)間2～3周。

莖段愈傷組織誘導(dǎo)：取試管苗莖基部不帶芽的莖段，在MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.7%培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，pH值5.8。

1.2 試驗(yàn)處理

①紫外線輻照 在超凈工作臺(tái)上，將新鮮、嫩綠的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使之形成一薄層，在超凈工作臺(tái)的紫外燈（220 V，25 W）下垂直距離43 cm處進(jìn)行照射試驗(yàn)。 試驗(yàn)設(shè) 7個(gè)處理， 即分別用紫外線輻照0，2，3，4，5，6，7 min（注：在進(jìn)行輻照處理前，紫外燈須提前30 min打開(kāi)，以確保光譜穩(wěn)定），然后立即將其移入培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.25 mg/L+ 2，4-D 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 3%+瓊脂0.7%上進(jìn)行暗培養(yǎng)，大約14 d后再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+6-BA 5.0 mg/L+GA310 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.7%上進(jìn)行培養(yǎng)。

②紫外線輻照+4℃低溫處理 紫外線輻照及暗培養(yǎng)方法同①，經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)14 d后，將其再次轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基上，然后放入4℃的低溫培養(yǎng)箱中，保存一個(gè)月，之后再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+6-BA 5.0 mg/L+GA310 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.7%上進(jìn)行培養(yǎng)。

③再生苗擴(kuò)繁移栽 紫外線輻照或紫外線輻照+4℃低溫處理后的再生試管苗，在MS+蔗糖3%+瓊脂0.7%培養(yǎng)基上擴(kuò)繁3代，經(jīng)煉苗后于2007年11月23日移栽于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地大棚，后又轉(zhuǎn)移到湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室。生長(zhǎng)期間對(duì)其進(jìn)行日常管理，如定時(shí)澆水、施肥、除雜草等。

④試管苗扦插 分別選取對(duì)照及不同處理生長(zhǎng)3～4片葉的植株，于500 mg/L的生根劑溶液中浸泡30 min，然后扦插在土盆里，其基質(zhì)的配比為：珍珠巖∶沙子∶菌渣∶泥土=2∶1∶2∶0.5，每個(gè)盆種植3株，盆栽材料移置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室，室內(nèi)溫度設(shè)為18～25℃，濕度80%，光照時(shí)間14 h/d，光強(qiáng)為地面上是1.3萬(wàn)lx，燈下1 m是2.7萬(wàn)lx。待植株成活后，施加少量復(fù)合肥。

1.3 調(diào)查項(xiàng)目與方法

試管苗觀察：觀察記載不同時(shí)期試管苗生長(zhǎng)速度、株型、葉色等的變化特征。

棚栽苗及扦插苗的觀察：觀察植株有無(wú)匍匐莖、花蕾、腋芽等。

葉片脯氨酸、可溶性糖含量的測(cè)定：脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線照射時(shí)間對(duì)莖段愈傷組織存活量及存活率的影響

愈傷組織經(jīng)過(guò)紫外線處理后，生長(zhǎng)受到明顯的抑制，表1列出了不同處理時(shí)間對(duì)愈傷組織存活率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響。

由表1可以看出，莖段愈傷組織對(duì)紫外線照射比較敏感，總體表現(xiàn)出隨著照射時(shí)間的增加，愈傷組織受損程度加重，褐變程度加大，存活率降低。當(dāng)紫外線照射2 min時(shí)，愈傷組織的外觀出現(xiàn)微小的變化，顏色與對(duì)照相比變淡，為淡綠色，2周后觀察到有部分材料死亡。當(dāng)處理時(shí)間大于2 min時(shí)，處理時(shí)間越長(zhǎng)，愈傷組織的反應(yīng)越明顯，表現(xiàn)為存活量明顯降低，顏色由淡綠色轉(zhuǎn)為褐綠色，甚至褐色，存活率大大下降。

當(dāng)處理時(shí)間為3 min時(shí)，莖段愈傷組織存活率和存活量大幅下降，其中存活率下降了30%；處理時(shí)間為4 min以上時(shí)，莖段愈傷組織存活率不超過(guò)50%，因此，3～4 min可能是紫外線加低溫誘導(dǎo)大西洋馬鈴薯莖段愈傷組織變異的最適宜時(shí)間。

2.2 紫外線照射和紫外線+低溫處理對(duì)莖段愈傷組織分化率的影響

愈傷組織的分化能力是衡量愈傷活力的重要參考依據(jù)，愈傷材料經(jīng)過(guò)紫外線和紫外線+低溫處理后，接種于最優(yōu)的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，以沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的愈傷組織作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的分化能力也受到了影響，表2、表3分別為紫外線和紫外線+低溫處理對(duì)愈傷組織進(jìn)行不同時(shí)間處理后的分化率。

①由表2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，隨著紫外線處理時(shí)間的增加，愈傷組織的分化能力呈下降趨勢(shì)，當(dāng)照射時(shí)間為4 min，愈傷組織的分化率為48.9%，3周后觀察，沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的大西洋馬鈴薯愈傷組織開(kāi)始分化，5周后觀察，2 min處理的愈傷組織開(kāi)始分化，6周后觀察，3，4 min處理的愈傷組織有不定芽形成，隨著紫外線處理時(shí)間的增加，不定芽的形成時(shí)間也隨之延長(zhǎng)，分化率也隨之降低。

②由表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)紫外線和1個(gè)月4℃的低溫共同作用，大西洋馬鈴薯愈傷組織的分化能力比單獨(dú)經(jīng)過(guò)紫外線處理的分化能力明顯降低。由此表明，4℃的低溫處理對(duì)大西洋馬鈴薯愈傷組織的分化能力有一定的抑制作用。對(duì)照的愈傷組織分化能力由原來(lái)的98.5%降至為86.4%，開(kāi)始分化時(shí)間由原來(lái)的3周延遲到5周。當(dāng)照射時(shí)間為3 min，愈傷組織的分化率由原來(lái)的53.7%降至為47.8%，不定芽的形成時(shí)間由原來(lái)的第6周推遲到第9周。當(dāng)照射時(shí)間為4 min，愈傷組織的分化率由原來(lái)的48.9%降至為43.2%，愈傷組織不定芽的形成時(shí)間也隨之延遲。隨著低溫和紫外線處理時(shí)間的增加，分化率也隨之降低，不定芽的形成時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。

表1 莖段愈傷組織對(duì)紫外線照射不同時(shí)間的反應(yīng)

總之，根據(jù)輻照和輻照+低溫處理后愈傷組織的分化能力，認(rèn)為以誘變?yōu)槟康牡淖贤饩€輻照的適宜時(shí)間為3～4 min。

表2 紫外線不同處理時(shí)間對(duì)愈傷組織分化率的影響

表3 紫外線+4℃溫度處理對(duì)愈傷組織分化率的影響

2.3 紫外線誘變?cè)偕仓甑蔫b定

①再生植株后代的形態(tài)變異 處理后的再生植株早期表現(xiàn)生長(zhǎng)減慢或停止，節(jié)間變短，株高普遍小于正常植株。繼代數(shù)次后逐漸觀察到莖色變綠、不定根生長(zhǎng)異常等變異現(xiàn)象。進(jìn)入盆栽和扦插苗階段仍發(fā)現(xiàn)新的性狀變異，如腋葉變異、匍匐莖變異、花期變異等。

腋葉變異，指腋葉出現(xiàn)的早晚和多少。處理2的植株腋葉出現(xiàn)的比對(duì)照植株早和多。由此可以看出，在生長(zhǎng)條件相同的情況下，紫外線處理打破了植株苗期頂端優(yōu)勢(shì)，有利于植株腋芽的形成，而低溫處理更可促進(jìn)植株健壯生長(zhǎng)，為后期馬鈴薯塊莖的形成奠定了基礎(chǔ)（圖1，2，3）。

圖1 對(duì)照組的扦插苗

圖2 紫外線處理的扦插苗

圖3 紫外線+低溫處理的扦插苗

匍匐莖變異，指在生長(zhǎng)期間匍匐莖有無(wú)和多少。沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的試管苗在苗期匍匐莖大量出現(xiàn)，發(fā)生概率為88.6%，處理1匍匐莖發(fā)生概率為43.2%，處理 2匍匐莖出現(xiàn)少，發(fā)生概率僅為12.4%。由此可以看出，愈傷階段的處理不利于試管苗在苗期形成匍匐莖。

開(kāi)花期變異，指在幼苗生長(zhǎng)期間花蕾形成的早晚和有無(wú)。在2008年3月9日發(fā)現(xiàn)處理2中編號(hào)為A14，A71的植株有花蕾形成；3月13日發(fā)現(xiàn)處理1編號(hào)為B1的植株有花蕾形成；3月19日處理1編號(hào)為B2，B4，B11的植株有花蕾形成，處理2有8棵植株有花蕾形成，其編號(hào)為A23，A24，A11，A49，A68，A64，A61，而在此期間對(duì)照未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)花蕾的植株。綜合計(jì)算，處理2有花蕾形成的植株占總數(shù)的7.1%，處理1有花蕾形成的植株占總數(shù)的4.0%。通過(guò)測(cè)定各處理植株葉片中游離脯氨酸和可溶性糖含量發(fā)現(xiàn)，花蕾形成早的植株其體內(nèi)的游離脯氨酸和可溶性糖的含量都比較高，表明愈傷階段的處理不僅有利于植株開(kāi)花期提前，大大縮短植株的生育期，而且還可以提高大西洋馬鈴薯植物組織內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖的含量，為大西洋馬鈴薯早熟品種的選育提供有利的幫助。

表4 群體植株葉片內(nèi)游離脯氨酸測(cè)量結(jié)果

表5 群體植株葉片內(nèi)可溶性糖測(cè)試結(jié)果

②葉片內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定 將半致死劑量分化得到的再生植株煉苗后進(jìn)行移栽，生長(zhǎng)一段時(shí)間后，取一定數(shù)量的對(duì)照、處理1和處理2的植株，選取處于同一生長(zhǎng)期的葉片，測(cè)定其游離脯氨酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理1和處理2均有部分植株脯氨酸含量大于或小于對(duì)照，其中處理1有3株的葉片低于對(duì)照，變異率為3%（總株數(shù)為100）；脯氨酸含量高于對(duì)照的有9株，變異率為9%，88%的植株脯氨酸含量與對(duì)照相差不大。而處理2總的變異率為17%（其中低于對(duì)照的為1.4%，高于對(duì)照的為15.6%，總株數(shù)為140）。

測(cè)定其葉片內(nèi)游離脯氨酸含量，計(jì)算平均值，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)紫外線處理的再生植株葉片游離脯氨酸的平均含量是對(duì)照組的1.05倍；經(jīng)紫外線和低溫共同處理的再生植株葉片內(nèi)的游離脯氨酸平均含量是對(duì)照組的1.25倍，但2個(gè)處理間游離脯氨酸平均含量相差不大，因此認(rèn)為紫外線或紫外線和低溫的共同誘變處理均能有效提高葉片內(nèi)游離脯氨酸的含量。

表6 紫外線誘變后再生植株葉片內(nèi)脯氨酸和糖的方差分析

表7 紫外線＋低溫處理后再生植株葉片內(nèi)脯氨酸和糖的方差分析

③葉片內(nèi)可溶性糖含量的測(cè)定 通過(guò)調(diào)查不同單株間的可溶性糖含量差異發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，處理1中可溶性糖含量低于對(duì)照的有3株（總株數(shù)100），變異率為3%，高于對(duì)照的有15株，變異率為15%；而處理2可溶性糖含量低于對(duì)照的有3株（總株數(shù)140），變異率為2.1%，高于對(duì)照的有24株，變異率為17.2%。

分析經(jīng)處理后的再生植株和未經(jīng)處理的再生植株體內(nèi)可溶性糖的含量，得平均值，結(jié)果見(jiàn)表5，處理后的再生植株體內(nèi)可溶性糖的平均含量都比對(duì)照高，且處理2的葉片可溶性糖含量高于處理1，這說(shuō)明紫外線或紫外線和低溫的共同作用都可以提高組織內(nèi)的可溶性糖的含量。

④變異株體內(nèi)游離脯氨酸和可溶性糖的關(guān)系由表6可以看出，各F值間的關(guān)系是脯氨酸大于可溶性糖，說(shuō)明莖段愈傷組織經(jīng)過(guò)紫外線誘變后，再生植株葉片內(nèi)脯氨酸含量為主效因子，糖含量為次效因子。由此可以得出，經(jīng)過(guò)紫外線誘變處理后，植物體內(nèi)脯氨酸的含量可以作為一個(gè)首先考慮的生理生化測(cè)定指標(biāo)。

由表7可以看出，各F值間的關(guān)系是脯氨酸大于可溶性糖，說(shuō)明莖段愈傷組織經(jīng)過(guò)紫外線誘變后，在經(jīng)過(guò)4℃低溫保存一個(gè)月，再生植株葉片內(nèi)脯氨酸的含量為主效因子，糖的含量為次效因子。由此可以得出，經(jīng)過(guò)紫外線和低溫共同處理后，植物體內(nèi)脯氨酸的含量可以作為一個(gè)首先考慮的生理生化測(cè)定指標(biāo)。

3 小結(jié)與討論

紫外線作為一種誘變劑，具有操作方便、安全、無(wú)污染、無(wú)化學(xué)殘留、誘變力強(qiáng)等特點(diǎn)。目前研究大多集中在UV-B輻照對(duì)植物形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面的影響，而對(duì)UV-C輻射對(duì)植物方面研究的較少[1]。在誘導(dǎo)愈傷組織誘變上，秦改花[2]對(duì)紅地球葡萄的莖段離體培養(yǎng)及愈傷組織的紫外線照射試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，葉片愈傷組織小顆粒的紫外線照射適宜時(shí)間是1～2 min，莖段愈傷組織的紫外線照射的適宜時(shí)間是3～4 min，但未見(jiàn)到芽的分化。李波等[3]對(duì)紫外線誘變苜蓿愈傷組織抗旱性的研究結(jié)果表明，誘變處理的POD、可溶性蛋白、脯氨酸含量均比未處理的高。本試驗(yàn)以大西洋馬鈴薯莖段愈傷組織為試驗(yàn)材料，進(jìn)行誘變研究。初步結(jié)論是：①紫外線或紫外線和4℃低溫能夠有效滲入生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞。②誘變劑的處理使試管苗生長(zhǎng)量顯著小于對(duì)照。③大西洋馬鈴薯在紫外線照射4 min或紫外線照射3 min和4℃低溫保存一個(gè)月后引起了可以肉眼看到和分析的變異，包括匍匐莖變異、花期變異、腋葉變異，葉片中脯氨酸、可溶性糖含量的變異，而且這些變異在同一棵植株上表現(xiàn)具有相關(guān)性。

本試驗(yàn)初步證實(shí)，紫外線輻照或紫外線輻照和4℃低溫作用結(jié)合莖段組織培養(yǎng)是一條可以使大西洋馬鈴薯產(chǎn)生變異的誘變途徑。但這種變異是否能夠在后代中保持，仍需要進(jìn)一步的研究。

[1]鄭有飛，顏景義，萬(wàn)長(zhǎng)健.紫外輻射增加對(duì)農(nóng)作物的影響及其對(duì)策[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象，1996，16（2）：15-19.

[2]秦改花.紅地球葡萄的莖段離體培養(yǎng)及愈傷組織的紫外線照射試驗(yàn)[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[3]李波，賈秀峰，焦德志，等.紫外線誘變苜蓿愈傷組織抗旱性的研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2005，26（6）：103-105.

Effects of Ultraviolet Radication on Potato Stem Callus and its Regeneration Plant

CHEN Aiqin1,AI Xin2
(1.Plant Protection Station of Linfen County,Shanxi 031500;2.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University,Changsha 410128)

The stem segments of Atlantic potato treated with UV-C,and treatment effects of UV-C on tetraploid potato Atlantic were studied through investigation of plant regeneration process and morphology of the regenerated plantlets in vitro,plastic tunnel observation and physiological index of the plants grown in Artificial climate room.The UV-C and four temperature could penetrate into the cells of growing point.Growth increment of plantlets in vitro derived from the stem segments treated with UV-C or UV-C and four temperature was significantly lower than that of controls,and variations of the regenerated plants and their organs were observed.The experimental data indicated that UV-C or UV-C and four temperature treatment of stem segments in UV-C for 4 min or UV-C for 3 min and four temperature could produce obvious mutations,as the foundation work,has provided reference for further research in this field.

Atlantic potato;Stem segment;Ultraviolet;Physical mutagenesis

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.004

陳愛(ài)芹（1981-），女，植保站干事，主要從事蔬菜抗性研究，電話：15935774033，E-mail：chenaiqin0101@163.com.cn

艾辛（1963-），男，通信作者，教授，主要從事蔬菜生物學(xué)技術(shù)研究，電話：15874245032，E-mail：caqgh2005@yahoo.com.cn

2010-06-11