超高效液相色譜測定蜂蜜及其制品中的苯甲酸、山梨酸

黃京平，李 熠，周金慧，吳黎明，陳蘭珍，趙 靜，薛曉鋒,*

(1.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2. 農業部國家蜂產品加工專業分中心，北京 100093)

超高效液相色譜測定蜂蜜及其制品中的苯甲酸、山梨酸

黃京平1,2，李 熠1,2，周金慧1,2，吳黎明1,2，陳蘭珍1,2，趙 靜1,2，薛曉鋒1,2,*

(1.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2. 農業部國家蜂產品加工專業分中心，北京 100093)

研究蜂蜜及其制品中的山梨酸與苯甲酸兩種防腐劑的提取凈化及其超高效液相色譜檢測方法。樣品用水溶解，超聲波輔助提取樣品中的山梨酸與苯甲酸。樣液經高速離心，濾膜過濾后，采用超高效液相色譜梯度洗脫與二極管陣列檢測器測定樣品中的山梨酸與苯甲酸的含量。以BEH Shield RP18(2.1mm×100mm，1.7μm)為色譜柱，以0.02mol/L乙酸銨溶液和乙醇為流動相梯度洗脫，兩種防腐劑在4min中內實現較好的分離。方法檢出限：苯甲酸為2.5mg/kg，山梨酸為2.0mg/kg。以加標樣品做添加回收率測定，苯甲酸與山梨酸的回收率分別為94.1%～102.3%和96.2%～99.8%，相對標準偏差均小于5%。方法簡單、快速準確、靈敏度高，是一種較好的定性和定量方法。

蜂蜜；蜂蜜制品；苯甲酸；山梨酸；超高效液相色譜

苯甲酸和山梨酸是目前食品加工業最常使用的兩種食品防腐劑，被廣泛用于各類食品中。食用含有過量苯甲酸和山梨酸的食品會影響人體對維生素和鈣的吸收，加重人的肝臟負擔，并引起毒性反應或誘發癌癥[1]。FAO與WHO詳細規定了不同食品中苯甲酸與山梨酸的使用范圍與用量，我國也對防腐劑的使用有著嚴格規定，國家食品添加劑使用衛生標準(GB 2760—2007《食品添加劑使用衛生標準》)規定了各類食品中苯甲酸與山梨酸的使用限量。一些國標檢測方法也已頒布，用于監控食品中苯甲酸和山梨酸的不合理使用。比如，GB/T 5009.9—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》[2]；GB/ T 23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定：高效液相色譜法》[3]；GB 21703—2010《乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定》[4]。

近些年來，受利益驅使，有些不法企業用一些果葡糖漿，人工色素(日落黃)，防腐劑(苯甲酸、山梨酸)等做成假蜂蜜以天然蜂蜜或制品投入市場，牟取暴利，嚴重危害了消費者的權益。GB 18796—2005《蜂蜜》強制標準中規定蜂蜜：“不得添加或混入任何防腐劑、澄清劑、增稠劑等異物[5]”。盡管一些防腐劑的國家標準檢測方法已經頒布，但這些標準主要用于醬油、蔬菜、奶制品中的苯甲酸與山梨酸的測定，還沒有相關蜂蜜產品及其制品(蜜膏、蜜乳)中山梨酸與苯甲酸的檢測方法。建立一個簡單、快速的蜂蜜及其制品中的苯甲酸與山梨酸的檢測方法，對于保護人民身體健康，完善現有蜂蜜質量與安全檢測方法體系，促進養蜂業快速健康發展有著重要意義。

苯甲酸和山梨酸的分析方法主要有紫外分光光度法[2,6]、氣相色譜法[2,7-8]、毛細管電泳法[9-10]、高效液相色譜法[2-4,11-15]，其中，高效液相色譜法是最常用的方法。近些年，隨著檢測技術的發展，在食品分析中，盡量減少使用有毒試劑，保護實驗人員的身體健康，保護自然生態環境已成為分析檢測技術的重要趨勢之一，人們將這種檢測技術稱之為環境友好的分析方法或綠色分析方法[16]。本實驗在樣品的提取和分析過程中，使用無毒和低毒試劑，建立一種使用8 0℃水浴提取與超高效液相色譜(UPLC)快速測定蜂蜜及其制品中的苯甲酸和山梨酸的方法，并分析一些實際樣品，調查這些樣品中兩種防腐劑的使用情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然蜂蜜 云南羅平與浙江平湖種蜂場；蜂蜜制品各地市場抽樣。

苯甲酸與山梨酸標準品 Sigma公司；無水乙醇和乙酸銨為色譜純 Baker公司。

0.02 mol/L乙酸銨溶液：稱取0.77g乙酸銨，用純水溶解，定容至500mL容量瓶中，使用前用0.2μm濾膜過濾。苯甲酸與山梨酸標準溶液(1mg/mL)：稱取適量苯甲酸與山梨酸標準品，用無水乙醇配制成1mg/mL標準貯備溶液，根據需要用純水配制成適合質量濃度的標準工作溶液。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜儀(配有PDA檢測器)、2K-15高速離心機、微孔濾膜(0.22μm) Waters公司；DK600A恒溫水浴 上海精密儀器公司；KQ218超聲波江蘇昆山舒美公司；Q-POD超純水器 密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取5g樣品到50mL容量瓶中，加入35mL水，混勻1min，在80℃水浴10min后，用超聲波超聲提取10min，將溶液放置室溫，用純水定容至50mL，取出5mL置于離心管中12000r/min離心5min，取上清液，用0.22μm濾膜過濾，上機分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters BEH Shield RP18(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動相：0.02mol/L乙酸銨溶液(A)和乙醇(B)；流速：0.40mL/min，梯度洗脫程序為0～1.2min，95% A；1.2～2.2min，60% A；2.2～4.0min，95% A；柱溫：45℃；進針體積：4μL；檢測器：全波長掃描，210～400nm，提取波長：230nm；以保留時間和紫外吸收光譜圖定性，峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 提取溶液及沉淀方法的選擇

常用提取苯甲酸與山梨酸的試劑有甲醇溶液、乙醚、鹽酸溶液、氨水和氫氧化鈉溶液等，其中，鹽酸溶液與乙醚的提取主要用于氣相色譜分析。甲醇溶液、氨水和氫氧化鈉溶液用于反相高效液相色譜分析。在樣品提取過程中，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液是常用的蛋白沉淀試劑，這兩種試劑均可以很好地沉淀樣品中的蛋白質，降低在測定苯甲酸與山梨酸過程中的基質干擾。這些提取和凈化方法均能很好地用于分析樣品中的苯甲酸和山梨酸，但這些方法在提取過程中用到酸、有機溶劑、重金屬鹽等，容易污染環境，同時對操作人員的健康也產生一定的影響。在本研究中，選擇水作為提取試劑，超聲波輔助下提取蜂蜜及其制品中的苯甲酸和山梨酸，通過水浴與高速離心沉淀樣品中的蛋白，方法可以有效地去除蜂蜜及制品中的蛋白及其他雜質，且能保證兩種防腐劑的提取回收率在90%以上。

2.2 超高效液相色譜條件的選擇

2.2.1 分離條件的選擇

用反相液相色譜分離苯甲酸和山梨酸時，通常使用C18色譜柱，用磷酸鹽或乙酸銨鹽溶液與甲醇或乙腈作為流動相等度洗脫分離，用紫外或二極管陣列檢測器檢測分析[2-4,11-15]。在本實驗選擇乙醇與0.02mol/L乙酸銨溶液作為流動相梯度洗脫分離苯甲酸和山梨酸，相比報道的分離方法，該方法快速、簡單，可以有效地將樣品中雜質與目標物分離，同時，乙醇、甲醇和乙腈相比，乙醇毒性小，對環境和操作人員的危害小。標樣和實際樣品分離色譜圖見圖1。

圖1 苯甲酸與山梨酸標樣(A)與實際樣品(B)測定色譜Fig.1 Chromatograms of benzoic acid and sorbic acid standards

2.2.2 波長的選擇

圖2 苯甲酸(A)與山梨酸標樣(B)紫外光譜圖Fig.2 UV-spectra of benzoic acid and sorbic acid standards

圖3 待測樣品中苯甲酸的紫外光譜圖Fig.3 UV-spectra of benzoic acid and sorbic acid in samples

在上述的色譜分析條件下，通過在210～400nm范圍進行掃描，苯甲酸的最佳吸收波長在223.8nm，山梨酸在254.3nm；文獻報道的檢測波長為230nm，在這個波長下，兩種防腐劑都有很好的響應，且基線穩定，因此本實驗選擇230nm為檢測波長，用兩種防腐劑在210～400nm的紫外光吸收譜圖作為定性分析的依據。兩種防腐劑的標準與實際樣品分析光譜圖如圖2、3所示。

2.3 線性關系和檢出限

用苯甲酸與山梨酸的標準溶液分別配制0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0mg/L混合標準溶液，在選定的色譜條件下進行測定，進樣量4μL，用峰面積與標準品質量濃度作圖，苯甲酸線性方程為Y=38023X＋6480.2，線性相關系數r≥0.9997；山梨酸性方程為Y=54497X＋4051.8，線性相關系數r≥0.9998。按照3倍信噪比計算，方法檢出限：苯甲酸2.5mg/kg，山梨酸2.0mg/kg。2.4回收率和精密度實驗

表1 苯甲酸和山梨酸的加標回收率和相對標準偏差(n=5)Table1 Recovery rates and RSD of benzoic acid and sorbic acid in spiked samples (n=5)

在空白樣品上作10、20、50mg/kg添加水平下進行加標回收率實驗，每個測定重復5次，測定的平均回收率及精密度見表1。在10～50mg/kg添加量范圍內回收率，苯甲酸與山梨酸的回收率分別為94.1%～102.3%和96.2%～99.8%，相對標準偏差均小于5%，能夠滿足日常蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的分析。

2.5 實際樣品的測定

應用本方法測定一些來自蜂場與市場的蜂蜜及其制品樣品中的苯甲酸和山梨酸的含量，調查蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的添加情況。在分析的56份樣品中，天然蜂蜜樣品中均未檢出苯甲酸與山梨酸，在一份蜂蜜制品(蜜膏)中檢出苯甲酸，含量為56.4mg/kg。通過光譜與保留時間確認為苯甲酸。實際樣品圖見圖1B和圖3。蜂蜜國家標準雖然規定了蜂蜜的質量標準，可以用這些標準判定蜂蜜產品是否合格，但對于蜂蜜制品，如蜜乳或蜜膏，因為沒有相關的標準，則無法對其質量與安全進行有效監管。從蜂蜜制品中檢出苯甲酸，說明蜂蜜制品存在一定的安全隱患，蜂蜜制品的質量與安全應該引起國家食品質量與安全管理部門的重視。

3 結 論

本實驗建立了一種快速、簡單、準確、靈敏度高且環境友好的超高效液相色譜測定蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的方法。方法適用于測定蜂蜜及其制品中的苯甲酸與山梨酸。將該方法用于測定實際樣品，調查苯甲酸和山梨酸在實際樣品中的添加情況。

[1]張根生. 食品中有害化學物質的危害與檢測[M]. 北京: 中國計量出版社, 2006: 16-22.

[2]GB/T 5009.29—2003 食品中山梨酸、苯甲酸的測定[S].

[3]GB/T 23495—2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定: 高效液相色譜法[S].

[4]GB 21703—2010 乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定[S].

[5]GB 18796—2005 蜂蜜[S].

[6]劉慧, 胡仰棟. 非線性優化迭代. 紫外分光光度法同時測定苯甲酸鈉和山梨酸鉀[J]. 分析實驗室, 2006, 25(10): 31-35.

[7]殷德榮. 毛細管氣相色譜法同時測定食品中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、尼泊金丙酯[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2004, 14(4): 469-470.

[8]張紅, 陳子雷, 王文博. 肉制品中山梨酸、苯甲酸的氣相色譜分析方法的研究[J]. 食品科技, 2007, 33(2): 235-236.

[9]王詠梅, 劉愷, 盧玉妹. 毛細管區帶電泳法測定食品中山梨酸、苯甲酸和糖精的含量[J]. 食品科技, 2007, 33(6): 227-229.

[10]FRAZIER R A, DOSSI N, NICOLO D, et a1. Development of a capillary electrophoresis method for the simultaneous analysis of artificeial sweeteners, preservatives and colours in soft drinks[J]. Journal of Chromatogr A, 2000, 875(1/2): 213-220.

[11]劉永剛, 李朝旭, 朱俊平. 乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉檢測方法的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(6): 260-262.

[12]劉洋, 陳枚. 液相色譜法可以同時檢測安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸[J]. 食品質量安全與檢測, 2007, 10(2): 30-31.

[13]王莉麗, 宋宇. HPLC法快速測定軟飲料中苯甲酸、糖精鈉、山梨酸的含量[J]. 渤海大學學報: 自然科學版, 2007, 28(2): 129-131.

[14]康紹英, 張繼紅. 二極管陣列. 高效液相色譜同時檢測食品中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸[J]. 食品與機械, 2007, 23(5): 118-120.

[15]李惠彬. 反相高效液相色譜法同時測定了9種食品中乙酰磺胺酸鉀、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉方法的研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2007, 17(7): 1173-1175.

[16]ARMENTA S, GARRIGUES S, de la GUARDIA M, et al. Green analytical chemistry[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2008, 27(6): 497-511.

Determination of Benzoic Acid and Sorbic Acid in Honey and Honey Products by Ultra-performance Liquid Chromatography

HUANG Jing-ping1,2，LI Yi1,2，ZHOU Jin-hui1,2，WU Li-ming1,2，CHEN Lan-zhen1,2，ZHAO Jing1,2，XUE Xiao-feng1,2,*
(1. Institute of Apiculture Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. National Research Center of Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100093, China)

In this article, extraction, clean-up and ultra-performance liquid chromatographic analysis of benzoic acid and sorbic acid in honey and honey products were investigated. The samples were dissolved in water first. Benzoic acid and sorbic acid were extracted by an ultrasonic method. After clean up processing with high-speed centrifugation and filtration, the extract was determined by an ultra-performance liquid chromatography with PDA detector. A gradient separation was achieved within 4 min using BEH Shield RP18column (2.1 mm ×100 mm, 1.7 μm) with ammonium acetate and ethanol as a mobile phase. The developed method was a simple, fast and sensitive. The limit of detection for benzoic acid and sorbic acid were 2.5 mg/kg and 2.0 mg/kg, respectively. The recovery rates of spiked benzoic acid and sorbic acid were 94.1%－102.3% and 96.2%－99.8%, respectively. The relative standard deviations were less than 5%. This method has been successfully applied to analyze some real samples from beekeeper and market for investigating the distribution of benzoic acid and sorbic acid in honey and honey products.

honey；honey product；benzoic acid；sorbic acid；ultra-performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0417-04

2010-05-12

國家現代農業(峰)產業技術體系項目(NYCYTX-43)

黃京平(1983—)，男，實習研究員，本科，主要從事蜂產品質量安全分析研究。E-mail：huang8210759@126.com

*通信作者：薛曉鋒(1979—)，男，助理研究員，博士研究生，主要從事蜂產品質量安全分析研究。E-mail：xue_xiaofeng@126.com