香菇中40種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜法測(cè)定

王會(huì)鋒，馮書(shū)惠，賈 斌

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

香菇中40種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜法測(cè)定

王會(huì)鋒，馮書(shū)惠，賈 斌

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

目的：建立香菇中24種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯、16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的氣相色譜測(cè)定方法。方法：稱取樣品于聚四氟乙烯離心管中，乙腈高速勻質(zhì)提取，上清液濃縮至近干，過(guò)Carbon/NH2SPE凈化柱，正己烷和丙酮定容，用GC-ECD和GC-FPD外標(biāo)法定量。結(jié)果：研究香菇中40種農(nóng)藥的檢測(cè)方法，方法的線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，回收率為73%～113%，重復(fù)性RSD為3.2%～5.9%，檢出限為0.0005～0.05mg/kg。結(jié)論：此氣相色譜法可以應(yīng)用于香菇等食用菌的多農(nóng)藥殘留量檢測(cè)。

農(nóng)藥殘留分析；香菇；食用菌；毛細(xì)管氣相色譜

當(dāng)前，我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)近年來(lái)發(fā)展趨勢(shì)良好，成為世界上最大的食用菌生產(chǎn)、出口大國(guó)，其產(chǎn)值在種植業(yè)中位居第六位，出口年創(chuàng)匯數(shù)億美元。但由于其栽培與加工技術(shù)相對(duì)落后，當(dāng)使用有農(nóng)藥污染的基質(zhì)載體或病蟲(chóng)害嚴(yán)重時(shí)的大量用藥，容易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)嚴(yán)重，出口時(shí)遇到世界貿(mào)易非關(guān)稅技術(shù)壁壘(農(nóng)殘限量極低)，極大阻礙出口[1-2]。相比國(guó)外食用菌農(nóng)殘指標(biāo)[3]，我國(guó)在《無(wú)公害食品 食用菌》中僅規(guī)定了敵敵畏、百菌清、多菌靈、溴氰菊酯4種農(nóng)藥的限量[4]。檢測(cè)食用菌中有機(jī)磷類農(nóng)藥、擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥和部分有機(jī)氯農(nóng)藥用3種前處理方法，耗時(shí)長(zhǎng)且繁瑣[5]。我國(guó)現(xiàn)有的食用菌標(biāo)準(zhǔn)中農(nóng)藥指標(biāo)和種類太少，不能反映我國(guó)食用菌生產(chǎn)實(shí)際，亟需發(fā)展快速、可靠、靈敏和實(shí)用的多農(nóng)藥殘留分析技術(shù)是控制農(nóng)藥殘留、保證食品安全的關(guān)鍵，以利于國(guó)內(nèi)消費(fèi)和出口。

香菇是一種重要食用菌，含有大量多糖、嘌呤、核酸等，檢測(cè)時(shí)前處理難度高。香菇溶劑提取后比較難過(guò)濾，更需要較高的凈化手段。當(dāng)使用Florisil柱和中性氧化鋁柱，無(wú)法除盡色素且對(duì)多種農(nóng)藥有吸附；若僅使用ENVI-Carb柱，則無(wú)法將色素和極性雜質(zhì)除盡[5-9]。所以凈化后基質(zhì)干擾仍然很大，無(wú)法準(zhǔn)確上機(jī)分析，結(jié)果容易誤判。目前，同時(shí)對(duì)鮮香菇和干香菇中多種農(nóng)藥殘留的分析尚未見(jiàn)報(bào)道[10]。本實(shí)驗(yàn)選取食用菌中的香菇為試樣，研究24種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯、16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的氣相色譜法檢測(cè)技術(shù)，能夠提高多組分農(nóng)藥分析的速度，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本；通過(guò)有效的凈化手段，減少假陽(yáng)性結(jié)果的錯(cuò)報(bào)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮香菇和干香菇為河南境內(nèi)抽檢樣品。

24種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯、16種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)樣(1mg/mL，編號(hào)及農(nóng)藥名稱見(jiàn)表1)，購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(天津)，使用時(shí)分別用正己烷、丙酮稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。乙腈、正己烷、丙酮、甲苯均為農(nóng)殘級(jí)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉均為分析純。

Agilent 6890N氣相色譜儀(μ-ECD；7890A，F(xiàn)PD)、SampliQ QuEChERS Extract Tubes Agilent公司；DB-608和DB-1701石英毛細(xì)管柱 J&W Scientific公司；氮?dú)狻錃?純度99.999%) 北京普萊克斯實(shí)用氣體有限公司；空氣發(fā)生器 北京匯龍公司；T18 Basic高速組織勻質(zhì)機(jī) IKA公司； EH-20B電加熱板 Lab Tech公司；BRAun CombiMax 600食品加工機(jī) 德國(guó)博朗公司；3C-3610低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新中佳分公司；BOND ELUT Carbon/NH2SPE柱(500mg/500mg，6mL) 美國(guó)瓦里安公司。

1.2 方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)各組分在氣相色譜上的靈敏度，設(shè)1～3組分別吸取編號(hào)為1～12、13～24和25～40號(hào)的農(nóng)藥標(biāo)樣(1mg/mL) 0.2～1.0mL于3個(gè)25mL容量瓶中，第1、2組為有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯標(biāo)液用正己烷定容，第3組為有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)液用丙酮定容，初步配成混標(biāo)中間液(8～40μg/mL)，再稀釋10倍作為混標(biāo)添加液(0.8～4.0μg/mL)，把混標(biāo)液分別用樣品本底溶液和純?nèi)軇?正己烷和丙酮)稀釋5、10、20、40、50倍作混標(biāo)工作曲線。

1.2.2 氣相色譜條件

有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥：GC-ECD色譜柱DB-608 (30m×320μm，0.5μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度300℃，程序升溫：初始溫度180℃以10℃/min的速度升至200℃保持2min，然后以5℃/min的速度升至260℃再以20℃/min的速度升至270℃保持20min；高純氮?dú)庵髁?.0mL/min，尾吹流量60mL/min。

有機(jī)磷農(nóng)藥：GC-FPD色譜柱DB-1701(30m×320μm，1.0μm)；進(jìn)樣口溫度230℃；檢測(cè)器溫度250℃，程序升溫：初始溫度80℃以20℃/min的速度升至200℃保持1min，然后以2℃/min的速度升至220℃保持1min后以30℃/min的速度升至250℃保持25min；高純氮?dú)庵髁?.0mL/min，尾吹流量60mL/min，H2流量75mL/min，空氣流量100mL/min；均采用恒流模式，不分流進(jìn)樣1μL。

1.2.3 樣品前處理

樣品制備：干、鮮香菇均用四分法取樣，于食品加工機(jī)中粉碎成干香菇粉、鮮香菇漿。

方法1：樣品提?。悍謩e稱取干香菇粉2.0g或鮮香菇漿10g(均精確至0.01g)于聚四氟乙烯離心管中，加入乙腈20mL，15000r/min均質(zhì)提取1.5min，加入5～7g NaCl搖勻，4200r/min離心5min，取上清液5mL于50mL燒杯中，通風(fēng)櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，加2mL乙腈-甲苯，待凈化；樣品凈化：于Carbon/NH2SPE柱中加入約2cm高無(wú)水硫酸鈉，放在固定架上，下接小燒杯。用10mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)預(yù)淋小柱，用3×2mL乙腈-甲苯洗滌樣液燒杯，并將洗滌液移入柱中，在柱上加上50mL貯液器，再用25mL乙腈-甲苯洗滌小柱，收集上述所有流出液于小燒杯中，通風(fēng)櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，正己烷定容至2mL，用于GC-ECD和GC-FPD的測(cè)定。

方法2：QuEChERS Extract Tubes快速方法實(shí)驗(yàn)。分別稱取干香菇粉2.0g和鮮香菇漿10g(均精確至0.01g)于50mL離心管中，加入無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉和20mL乙腈，旋緊蓋子劇烈振搖2min，4200r/min離心5min，取上清液5mL于10mL凈化離心管中，再次劇烈振搖2min后離心，收集所有樣液于燒杯中，通風(fēng)櫥里65℃電熱板上濃縮至近干，正己烷直接定容和過(guò)Carbon/NH2SPE凈化后定容至2mL上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

按照1.2.2節(jié)和方法1的分析條件，分別添加混標(biāo)添加液(0.8～4.0μg/mL) 0.2、0.5、1.0mL至空白干香菇和鮮香菇樣品中，每個(gè)水平添加3個(gè)樣品，用空白基質(zhì)配的混合標(biāo)樣定量，即以峰面積(A)和質(zhì)量濃度(c)作校正工作曲線圖外標(biāo)法計(jì)算。應(yīng)用此方法對(duì)在河南抽檢的53個(gè)干香菇、鮮香菇樣品進(jìn)行測(cè)定。由表1可見(jiàn)，本方法的回收率為73%～113%，線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，農(nóng)藥在香菇中的檢出限(RSN=3)為0.0005～0.05mg/kg。重復(fù)性RSD為3.2%～5.9%(表2)，相關(guān)氣相色譜圖比較見(jiàn)圖1～6。

比較圖2和圖4可知，基質(zhì)雜峰干擾程度：鮮香菇＞干香菇，不凈化＞SPE凈化＞快速方法+SPE凈化；比較圖3和圖5、6后得出基質(zhì)干擾程度：有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥測(cè)定＞有機(jī)磷農(nóng)藥測(cè)定，選擇快速方法+SPE凈化成本較高，振搖幅度有個(gè)體差別，不如高速均質(zhì)機(jī)提取出峰效果好。

表1 干、鮮香菇添加回收率、線性、檢出限、最大殘留限量的測(cè)定Table1 Recoveries in dried and fresh mushrooms, regression equation, linear range, correlation coefficient, LOD and MRL

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table1 2 Results of repeatability test (n=6)

圖1 正己烷、本底配制有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯標(biāo)樣(0.08～0.32 μg/mL)色譜圖Fig.1 Chromatograms of n-hexane and shiitake mushroom both fortified with pesticides No. 1 through 12 or with No. 13 through 24

圖2 干香菇及添加SPE凈化、不凈化測(cè)定第一組(1～12號(hào))農(nóng)藥色譜圖Fig.2 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.1 through 12 in dried shiitake mushroom

圖3 干香菇及添加QuEChERS+SPE凈化、SPE凈化、不凈化測(cè)定第二組(13～24號(hào))農(nóng)藥色譜圖Fig.3 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.13 through 24 in dried shiitake mushroom

圖4 鮮香菇及添加SPE凈化、QuEChERS+SP凈化測(cè)定第1、2組(1～24號(hào))農(nóng)藥色譜圖Fig.4 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.1 through 24 in fresh shiitake mushroom

圖5 干香菇及添加SPE、QuEChERS+SPE、QuEChERS、不凈化測(cè)定第三組(25～40號(hào))農(nóng)藥色譜圖Fig.5 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.25 through 40 in dried shiitake mushroom

圖6 鮮香菇及添加SPE凈化、QuEChERS測(cè)定第三組(25～40號(hào))農(nóng)藥色譜圖Fig.6 Effects of extraction methods and SPE cleanup on chromatographic separation of pesticides No.25 through 40 in fresh shiitake mushroom

3 討 論

3.1 依據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》提取[11]；按照GB/T 19648—2005《蔬菜和水果中446種農(nóng)藥多殘留測(cè)定方法氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》凈化[12]和參考QuEChERS快速方法，建立提取節(jié)約溶劑、凈化準(zhǔn)確高效的快速殘留分析方法。離心分層能盡大量收集到有機(jī)相，減少試劑揮發(fā)對(duì)測(cè)定濃度的影響。電熱板濃縮回收率在73%～113%之間。所以選擇均質(zhì)提取+離心分層+電熱板濃縮+SPE凈化的前處理方法，能適用于香菇等食用菌中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，結(jié)果能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

3.2 從圖1、5、6可以看出相同濃度的溶劑配制標(biāo)樣背景比較干凈，有利于定性，樣品基質(zhì)配制的標(biāo)樣有一些雜峰的干擾，色譜條件不合適時(shí)會(huì)影響定性定量。另外基質(zhì)標(biāo)樣比純?nèi)軇?biāo)樣出峰要高，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥影響大于有機(jī)磷農(nóng)藥。所以對(duì)有基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥[13]，一般建議用基質(zhì)標(biāo)樣定量，而不采用溶劑標(biāo)樣定量。本方法的回收率及測(cè)定采用基質(zhì)標(biāo)樣來(lái)校正。

3.3 氣相色譜法中DB-608和DB-1701柱的農(nóng)藥最低檢出限低于或等于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量(食用菌沒(méi)有專門(mén)的最大殘留限量參考蔬菜的MRL值)。由于GC-ECD靈敏度十分高，測(cè)定有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥時(shí)香菇基質(zhì)本底干擾比較大，六六六、滴滴涕、百菌清、腐霉利等小峰檢出比較多，容易造成結(jié)果誤判。所以對(duì)GC-ECD的檢測(cè)需要強(qiáng)有效的凈化技術(shù)。

3.4 檢出并超標(biāo)農(nóng)藥需要經(jīng)極性不同色譜柱或GC-MS確證。GC-MS確證可以選擇GC-MS/EI/SIM或GC-MSMS法[14]；確證柱GC-ECD可以選擇DB-1柱[15]，GC/FPD選擇HP-5柱進(jìn)行雙柱確證。在色譜柱選擇上，GC-ECD靈敏度：DB-1＞DB-608柱，但DB-608柱六六六峰形較尖，且基線分離，其他組分出峰勻稱分布，聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯分離完全，基質(zhì)干擾少，利于準(zhǔn)確定量；瑕疵是分析時(shí)間比DB-1柱長(zhǎng)10min，氯氰菊酯和氟氯氰菊酯分離不如DB-1柱完全，但多個(gè)峰加和不影響計(jì)算。3.5抽檢的53個(gè)香菇中測(cè)定百菌清、溴氰菊酯、甲胺磷、甲拌磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、敵敵畏等均未檢出(經(jīng)氣質(zhì)確證)，說(shuō)明河南香菇質(zhì)量安全比較讓人放心。

4 結(jié) 論

本法可以準(zhǔn)確可靠的應(yīng)用于香菇等食用菌中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。方法的線性范圍為0.016～0.80μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，回收率為73%～113%，重復(fù)性RSD為3.2%～5.9%，檢出限為0.0005～0.05mg/kg，可以應(yīng)用于香菇等食用菌的多農(nóng)藥殘留量檢測(cè)。

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GC Method for the Determination of Forty Pesticide Residues in Shiitake Mushroom

WANG Hui-feng，F(xiàn)ENG Shu-hui，JIA Bin
(Agricultural Quality and Standards and Testing Techniques Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou Center of Inspection and Testing for Agricultural Products, Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China)

Objective: To develop a capillary GC method for the determination of the residues of 24 organochlorines or synthetic pyrethroid and 16 organophosphorus pesticides in shiitake mushroom. Methods: Samples were weighed into Teflon centrifuge tubes and high-speed homogenized with acetonitrile, and the supernatant was then condensed until almost dry and applied to a carbon/NH2 SPE column for cleanup. After recondensation until almost dry, the eluate was rediluted with n-hexane before being injected into the analytical instrument. Electron capture detector was used to detect organochlorines and pyrethroids and flame photometric detector to detect organophosphorus. Using the external standard method, quantitation was carried out. Results: The linear range of the proposed method was between 0.016μg/mL and 0.80 μg/mL, with a correlation coefficient of larger than 0.999, and its recovery, repeatability RSD and detection limit varied from 73.0% to 113%, from 3.2% to 5.9% and from 0.0005 to 0.05 mg/kg. Conclusion: A simple, sensitive and reproducible method applicable to the determination of pesticide multiresidues in shiitake mushroom and other species of mushroom has been developed.

pesticide residue；shiitake mushroom；edible fungi；capillary GC

TS207.53

A

1002-6630(2010)20-0335-07

2010-01-05

王會(huì)鋒(1982—)，男，研究實(shí)習(xí)員，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：willup@163.com