多重PCR-DHPLC檢測4種主要致腹瀉性大腸埃希氏菌方法的建立與應用

徐義剛，崔麗春*，李蘇龍，曹際娟，姜艷春，張子群，劉新亮

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116065)

多重PCR-DHPLC檢測4種主要致腹瀉性大腸埃希氏菌方法的建立與應用

徐義剛1，崔麗春2,*，李蘇龍1，曹際娟3，姜艷春1，張子群1，劉新亮1

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116065)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)是引起腹瀉、危害食品安全和人類健康的4種主要大腸桿菌。本實驗基于ETEC LT基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵襲性質粒基因序列，設計了4對特異性引物，利用聚合酶鏈反應(PCR)和變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)技術，通過體系優化，建立了致腹瀉性大腸桿菌多重PCR-DHPLC檢測方法，達到同時檢測4種致病菌的目的。該方法靈敏度高，最低檢測限為EHEC 6×101拷貝/μL、ETEC 1.3×102拷貝/μL、EPEC 9×101拷貝/μL、EIEC 7×101拷貝/μL。特異性試驗表明，對22種共41株細菌進行檢測，所試6株致腹瀉性大腸桿菌均為陽性。實踐證明，該方法具有良好的實用性，可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的單一或混合感染的檢測。

致腹瀉性大腸桿菌； 聚合酶鏈式反應；變性高效液相色譜；檢測

微生物污染是影響我國食品安全最突出的因素之一。大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli) 也稱大腸桿菌，與人類疾病有關的大腸桿菌統稱為致腹瀉性大腸桿菌，常引起嚴重腹瀉和敗血癥[1-2]。致腹瀉性大腸桿菌按其生物學特性主要分為四類[3-4]：產腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)，在食品衛生與食品安全檢測方面具有重要的意義。

ETEC主要感染兒童和旅游者，發展中國家尤為嚴重，被污染的水和食物是主要傳染源，主要致病因素是大腸桿菌腸毒素LT或ST[5]，感染的臨床癥狀輕度時為溫和性腹瀉，嚴重時可發展為霍亂樣腹瀉癥狀[6]。EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴重者可致死，病原菌主要感染腸上皮細胞形成特征性的組織病理損傷[7]。EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉，曾爆發流行，臨床癥狀為水樣腹瀉，有時呈現痢疾癥狀[8]。EHEC主要血清型是O157:H7，引起散發性或暴發性出血性結腸炎，可產生志賀氏毒素樣細胞毒素[9]。

目前我國致腹瀉性大腸桿菌的檢測方法主要采用國標法(GB 4789.6—1994《食品衛生微生物學檢驗——致瀉大腸埃希氏菌檢驗》)，檢測程序為樣品→增菌→分離培養→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應試驗/腸毒素檢查等，操作復雜繁瑣，檢測時間長，需要4～7d，且檢測單一。變性高效液相色譜(DHPLC)是一種新的基因高通量分析技術，利用核酸分子通過固定相親和力的差異，用流動相洗脫時，不同大小或者不同序列的核苷酸片段在固定相上移動速率不同而達到分離的目的，具有全自動、高通量檢測的特點。在國內外的醫學、遺傳學方面逐漸得以應用，如SNP分析、雙鏈DNA片段分析、微衛星分析、mRNA定量分析、引物純度檢測等[10-14]。因此，可利用DHPLC區分不同長度DNA片段的特點，根據不同致病菌特有基因序列，設計引物進行PCR擴增，用DHPLC分析檢測，達到快速、高通量檢測食品中病原微生物的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌ATCC 25922、腸出血性大腸桿菌 O157: H7 ATCC 35150、產腸毒素大腸桿菌ATCC 35401、侵襲性大腸桿菌ATCC 43893、腸致病性大腸桿菌ATCC 11775、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、綿羊李斯特氏菌ATCC 33090、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、類志賀鄰單胞菌ATCC 14030、普通變形桿菌ATCC49027、豬霍亂沙門氏菌ATCC 10708、福氏志賀氏菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血性弧菌ATCC 27519、溶藻性弧菌ATCC33839、創傷弧菌ATCC 33149和小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC 9610來自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；溶血性鏈球菌CMCC32121來自中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；分離株由本技術中心實驗室分離保存。

1.1.2 試劑

Taq DNA Polymerase NEB公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 TaKaRa公司；復合增菌培養基BPW北京蘭伯瑞生物技術公司；三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純) Transgenomic公司；乙腈(色譜純) Fisher公司。1.2儀器與設備

PCR擴增儀 Eppendorf公司；凝膠成像儀 GE公司；電泳儀 Bio-Rad公司；Wave 4500系統、C18DNASep 色譜柱(4.6 mm×50 mm，3μm) Transgenomic公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據Genbank中EHEC O157:H7 O抗原基因、ETEC LT基因、EPEC bfpA基因和EIEC侵襲性質粒基因，利用引物設計軟件Primer5.0 設計4對PCR引物，引物由TaKaRa公司合成。

1.3.2 細菌培養及基因組DNA提取

將菌株分別接種于5mL復合培養基BPW中，按照每種細菌最適生長溫度培養過夜，利用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取，具體操作步驟詳見使用說明書。

1.3.3 PCR反應條件

單重PCR反應體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL、模板DNA 1μL，去離子水補充至25μL。單重PCR反應條件：95℃變性5min；95℃變性15s、60℃退火20s、72℃延伸60s，進行35個循環。多重PCR反應體系(25μL)：10×PCR緩沖液2.5μL、多重PCR引物(10μmol/L)濃度比ETEC: EHEC:EIEC:EPEC=1:1:1.3:1、dNTPs(10mmol/L)4μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)1μL、模板DNA 各1μL，去離子水補充至25μL。多重PCR反應條件：95℃變性5min；95℃變性20s、60℃退火30s、72℃延伸60s，進行40個循環。

表1 PCR引物序列Table1 Primers designed in this study for PCR amplification

1.3.4 DHPLC檢測條件

PCR產物上樣量5μL；柱溫50℃；流速0.9 mL/min；緩沖液洗脫梯度A：42%～58%，B：58%～42%；洗脫時間10min(A：50mL TEAA、250μL乙腈，去離子水定容至1000mL；B：50mL TEAA、250mL乙腈，去離子水定容至1000 mL)；洗脫的DNA在260nm進行紫外吸收檢測。

1.3.5 特異性實驗

試劑盒法提取1.1.1節中細菌的基因組DNA，利用建立的PCR-DHPLC方法進行檢測，以驗證方法的特異性。

1.3.6 靈敏度實驗

將4種致腹瀉性大腸桿菌的PCR產物克隆作為陽性質粒，260nm測定OD值，計算初始基因拷貝數，用去離子水進行10倍系列稀釋，取各稀釋度樣品5μL，以測試該方法的檢測靈敏度。

1.3.7 驗證實驗

將建立的檢測方法應用于檢驗檢疫實踐工作中，其結果與GB 4789.6—1994進行比較，驗證該方法的可靠性。

2 結果與分析

2.1 單重PCR-DHPLC檢測結果

圖1 致腹瀉性大腸桿菌單重PCR檢測結果Fig.1 Results of single PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

圖2 致腹瀉性大腸桿菌單重PCR擴增產物DHPLC檢測結果Fig.2 Results of DHPLC detection of single PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

基于4種致腹瀉性大腸桿菌特異性基因序列，設計了4對PCR擴增引物，通過反應體系及反應條件的優化，建立單重PCR方法，該方法能夠有效擴增出4種致病菌目的基因片段(圖1)。采用DHPLC技術檢測PCR產物(圖2)，結果顯示該技術能夠將片段大小不同的4種致病菌的PCR產物根據出峰時間的不同有效區分開。

2.2 多重PCR-DHPLC檢測結果

在單重PCR基礎上，經過反應體系和反應條件的優化，建立了4種致腹瀉性大腸桿菌多重PCR方法(圖3)。多重PCR產物經變性高效液相色譜技術檢測，結果見圖4，利用變性高效液相色譜技術能夠一次性檢測出片段大小不同的4種致病菌的PCR產物，根據出峰時間的不同有效的區分開。

圖3 致腹瀉性大腸桿菌多重PCR檢測結果Fig.3 Results of multiplex PCR detection of four diarrheogenic E.coli strains

圖4 致腹瀉性大腸桿菌多重PCR擴增產物DHPLC檢測結果Fig.4 Results of DHPLC detection of multiplex PCR amplification products of four diarrheogenic E.coli strains

2.3 特異性實驗結果

利用建立的檢測方法對表2中的細菌進行檢測，結果顯示，腸出血性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌和產腸毒性大腸桿菌等4種致腹瀉性大腸桿菌均為陽性，其他菌株為陰性，說明本研究所建立的檢測方法具有高度特異性。

2.4 靈敏度實驗

表2 特異性實驗結果Table2 Results of specificity evaluation

將4種致腹瀉性大腸桿菌的PCR產物克隆至質粒，作為陽性對照樣品，測定OD260值，計算初始基因拷貝數，然后將其進行10倍系列稀釋，取各稀釋度樣品5μL，用建立的檢測方法進行檢測，以測試其檢測靈敏度。結果顯示該方法對4種致病菌的檢測靈敏度分別為EHEC 6×101拷貝/μL、ETEC 1.3×102拷貝/μL、EPEC 9×101拷貝/μL和EIEC 7×101拷貝/μL。

2.5 實踐應用

表3 多重PCR-DHPLC檢測方法的實踐應用Table3 Applications of the developed PCR/DHPLC method

2009年1～11月期間，利用建立的多重PCR-DHPLC檢測方法對市場流通的各種肉類、奶類制品及人工污染食品樣品進行檢測，同時采用國標法(GB 4789.6—1994)進行驗證，結果見表3所示，共檢出陽性樣本42份，與國標法檢出結果相符合，說明所建立檢測方法切實可行，同時也反映出食品受到致腹瀉性大腸桿菌污染的普遍性。

3 結 論

食品安全是全球性的重大公共衛生問題， 每年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達數億起，死亡的0～15歲兒童約170萬人[15]。其中，致腹瀉性大腸桿菌是重要的病原之一，特別是嬰幼兒腹瀉，在我國及國外腹瀉患者中致腹瀉性大腸桿菌的檢出率、構成比、優勢類型及血清型不同[16-20]，給臨床診斷帶來不便。本研究針對4種主要的致腹瀉性大腸桿菌特異性靶基因，利用聚合酶鏈式反應(PCR)和變性高效液相色譜(DHPLC)技術建立的多重PCR-DHPLC檢測方法，可一次性檢出4種致腹瀉性大腸桿菌病原菌單一感染或混合感染，實現通量檢測。該多重PCR-DHPLC方法比常規的細菌分離鑒定敏感度高，檢測快速，通量高，同時避免了PCR方法產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測EB對人體和環境帶來的潛在危害。該方法可用于臨床病例的快速診斷和流行病學調查，對保障食品安全和人類健康具有現實意義。

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Development and Application of a Multiplex PCR/DHPLC Method for Detecting Four Common Diarrheogenic Escherichia coli Strains

XU Yi-gang1，CUI Li-chun2,*，LI Su-long1，CAO Ji-juan3，JIANG Yan-chun1，ZHANG Zi-qun1，LIU Xin-liang1
(1. Technical Centre, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China；2. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；3. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116065, China)

Four pairs of specific primers were designed according to the sequences of the LT gene from enterotoxigenic E.coli (ETEC), the bfpA gene from enteropathogenic E.coli (EPEC), the O antigen gene from enterohemorrhagic E.coli (EHEC) and the invasive plasmid gene from enteroinvasive E.coli (EIEC) for the development of a multiplex polymerase chain reaction/denaturing high performance liquid chromatography (PCR/DHPLC) method for the simultaneous detection of the four common diarrheogenic E.coli strains. The PCR/DHPLC method had high sensitivity and its detection limit was 6×101copies/μL for EHEC, 1.3×102copies/μ L for ETEC, 9×101copies/μ L for EPEC and 7×101copies/μ L for EIEC. The specificity evaluation showed that 6 of 41 stains from 22 species were determined to be positive. This method proves to be applicable and suitable for the detection of infection with one or more of the four E.coli strains.

diarrheogenic E.coli；PCR；DHPLC；detection

R155.1；R378.2.1

A

1002-6630(2010)20-0293-05

2010-02-08

黑龍江省青年基金項目(QC2009C90)；黑龍江省博士后基金項目(LBH-Z09)

徐義剛(1978—)，男，獸醫師，博士，研究方向為病原微生物診斷與防治。E-mail：yigangxu_china@yahoo.com.cn

*通信作者：崔麗春(1977—)，女，副研究員，博士，研究方向為微生物學。E-mail：degree82191656@yahoo.com.cn