Fascin、β-catenin、E-cadherin 在大腸腺瘤癌變過程中的表達及意義

宋曉昕

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，我國結腸癌發病率和死亡率有逐年增加的趨勢。侵襲和轉移是導致結腸癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因之一。目前認為腫瘤轉移是一種主動過程，需要腫瘤細胞運動，從原發灶脫離，穿破結締組織構成的基底膜及血管淋巴管壁的機械屏障，進入體液循環，最后再次穿透血管淋巴管壁在靶器官定位，并在該處擴增成轉移灶，可基本概括為癌組織在浸潤轉移前進行細胞自身的粘附解除;癌細胞粘附于基質;癌細胞釋放蛋白水解酶降解基質(ECM);癌細胞的移行等。Liotta等［1］將此概括為腫瘤細胞浸潤轉移的3步假說，即粘附、降解和移動。雖然腫瘤的侵襲轉移是多基因參與、多步驟完成的復雜過程，但是腫瘤細胞間粘附減弱和腫瘤細胞運動能力增強無疑是腫瘤發生侵襲轉移的基礎。本研究應用免疫組織化學技術檢測Fascin、β-連接素(βcatenin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)蛋白在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變和大腸癌中的表達及其關系，以探討Fascin、β-連接素(β-catenin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)在大腸癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集:50例大腸腺瘤取自2003年1月至2008年12月我院內鏡活檢標本，其中輕度異型增生19例，中、重度異型增生31例。大腸腺瘤癌變病例30例及大腸癌40例取自同期我院手術切除標本作為研究對象，同時以大腸黏膜20例作為對照(均取腸癌標本距腫物10 cm以上的大腸黏膜)。本組研究病例中，男63例，女57例;年齡22～81歲，平均年齡56.1歲;55歲以下43例，55歲以上77例。40例大腸癌中，浸潤深度未侵及漿膜13例，侵及漿膜27例;無淋巴結轉移24例，有淋巴結轉移16例;Dukes分期A+B期24例，C+D期16例，高-中分化29例，低-未分化11例。所有病例全部切片均由兩位高年資病理醫師嚴格按照2000年WHO標準［2］進行明確診斷復核。所有標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片。

1.1.2 試劑:鼠抗人 Fascin、E-cadherin、β-catenin 單克隆抗體，通用型SP檢測試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法 免疫組織化學按免疫組織化學增強型試劑盒說明書進行，每批染色均設陰、陽性對照，即以PBS替代一抗作為陰性試劑對照，以試劑說明書中推薦的組織切片為陽性組織對照。最佳一抗稀釋度的標準是能得到最大的抗原染色強度和最低的背景染色。免疫組化標記采用SP法，抗原修復采用檸檬酸鹽緩沖液中加熱，保持92～98℃ 15 min，室溫下自然冷卻。DAB顯色。

1.3 染色結果判斷 Fascin蛋白陽性產物主要定位于細胞漿，表現為胞漿內有棕黃色顆粒。在間質中高表達，因此，在間質中的表達可以作為內對照。免疫組織化學染色結果采用以下判斷標準［3］。將染色程度評分:無色記0分、淡黃色記1分、棕黃色記2分和棕褐色記3分;再將陽性細胞所占的百分比評分:0分為陰性、陽性細胞數≤10%記1分、11% ～50%記2分、51%～75%記3分、＞75%記4分，然后計算兩者的乘積。乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。E-cadherin、β-catenin主要表達于正常黏膜上皮的細胞膜上，在相鄰的細胞間隙呈連續點狀或同質線狀分布，以細胞膜為陽性表達部位作為陽性對照。β-catenin染色結果判斷標準按照Maruyama等［4］方法，細胞膜陽性表達＞70%為正常表達;細胞膜陽性表達＜70%為表達缺失;細胞質或細胞核＞10%陽性為胞質或胞核陽性表達;胞質或胞核表達稱為異位表達;細胞膜表達缺失、胞質或胞核表達統稱為表達異常。E-cadherin染色結果以癌細胞細胞膜陽性表達＞70%為正常表達，＜70%為表達缺失。

1.4 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，計數資料采用用χ2檢驗，Fisher確切概率計算法及相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種蛋白在不同大腸組織中的表達 fascin蛋白標記定位在癌細胞的胞質中，呈棕黃色顆粒狀，β-catenin、E-cadherin正常表達定位于上皮細胞膜，大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變和大腸癌組織β-catenin、E-cadherin胞膜表達不同程度缺失，β-catenin呈胞漿和(或)胞核異位表達。正常大腸黏膜組織、大腸腺瘤、大腸腺瘤惡變、大腸癌組織中fascin、β-catenin、E-cadherin的表達情況。見表1。

表1 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在不同大腸組織中的表達例(%)

2.2 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白表達與大腸癌臨床病理參數的關系 見表2。

表2 Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表達與大腸癌中臨床病理因素的相關性 例(%)

2.3 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在大腸癌中表達的相關性 Fascin陽性表達與β-catenin異位表達呈正相關(r=0.711，P ＜0.01);Fascin陽性表達與E-cadherin膜表達呈負相關(r= －0.803，P ＜0.01);β-catenin膜表達 E-cadherin膜表達呈正相關(r=0.849，P ＜0.01)。見表 3。

表3 大腸癌中Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表達的相關性例

3 討論

侵襲、轉移行為是惡性腫瘤的本質特性。腫瘤細胞遷移和侵襲的起始步驟是細胞向遷移的方向伸出突起［5］。研究發現細胞的運動是由actin的組裝狀態所驅動的，細胞通過組裝actin纖維分支網絡而形成運動前緣的細胞突起［6］。人類fascin-1基因屬于fascin家族，其基因編碼產物是一種細胞骨架蛋白，可與F-actin結合，又稱為actin束蛋白，定位于細胞質應力纖維 (stressfibers)、細胞膜皺褶 (membraneruffies)邊緣的絲狀偽足(filopodia)、微刺(mierospikes)的核心actin束中，在細胞遷移時集中于細胞前緣的突起［7］。Fascin蛋白在正常上皮細胞中不表達或低表達，但在一些上皮組織腫瘤中常表達上調。fascin的過度表達可導致細胞間粘著力降低和細胞運動活性增加。

E-cadherin/β-catenin復合體是介導同型細胞間粘附的連接復合體，其在維持正常上皮的極性和完整性中起重要作用，腫瘤細胞間粘附的喪失是腫瘤侵襲、轉移的關鍵。

Catenins是第一個具有連接細胞-細胞黏附分子cadherin的細胞質區至actin骨架蛋白特征的分子，它的基本作用是調整cadherin的黏附性。而fascin將actin細絲束縛至β-catenin的中央Armadillo重復區，fascin and E-cadherin與β-catenin結合利用相似的結合位點，形成互助的復合體。fascin and E-cadherin局限于細胞-細胞邊緣及動態細胞如上皮和內皮細胞的前沿。β-catenin可能參與fascin聯合調整細胞骨架動力學［8］。

本研究結果表明Fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白在大腸黏膜—腺瘤—腺瘤癌變—癌序列中的胞漿/胞膜陽性表達呈逐步增強/減弱趨勢，β-catenin異位表達逐步增強。Fascin/E-cadherin、β-catenin在結直腸癌組織中的陽性表達明顯高于/低于正常黏膜及腺瘤組織中的表達(P＜0.05);Fascin陽性表達與β-catenin異位表達呈正相關(r=0.711，P ＜0.01)，Fascin 陽性表達與 E-cadherin膜表達呈負相關(r=－0.803，P ＜0.01)，β-catenin膜表達 E-cadherin膜表達呈正相關(r=0.849，P ＜0.01)。本研究對 fascin、E-cadherin、β-catenin 蛋白在結、直腸癌組織中表達的臨床病理意義進行比較分析，結果表明，隨淋巴結轉移的發生、腫瘤侵潤深度不斷增加，組織學分級的增高及臨床分期的進展，fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白的陽性表達率均明顯增高/減低(P＜0.05)。而與患者的年齡、性別無關(P＞0.05)。提示Fascin陽性表達的腫瘤往往有較高的組織學分級或者較高的侵襲性。E-cadherin/β-catenin復合體黏附特性的改變也可能導致細胞骨架的重排。從而促進腫瘤的浸潤轉移。

研究發現，正常膽管上皮細胞不表達fascin而在癌細胞中經常有陽性表達［9］。侵襲性腫瘤細胞大量地表達fascin，在腫瘤侵襲的前沿較其他區域更為常見。并且還發現增強fascin的免疫反應性有干擾E-cadherin和β-catenin的膜的免疫反應性。在fascin過表達的腫瘤細胞中E-cadherin和betacatenin在膜上的表達減低。還有研究者認為在結直腸癌中fascin表達可能受wnt途徑的調節［4］，導致fascin蛋白的異常表達，提高了細胞運動能力和移動性，促使細胞產生各種惡性行為。而最近對結腸癌的研究中發現，fascin是β-catenin-TCF信號通路的新靶點之一。Fascin、β-catenin、E-cadherin聯合應用有可能作為一種判斷預后的指標，從而早期識別那些具有高度侵襲和轉移潛能的腫瘤。而且fascin也很有可能成為一個新的基因治療靶點。

1 Liotta LA，Mandler R，Murano G，et al.Tumor cell autocrine motiling factor.Proc Natl Acid Sci USA，1986，83:3302-3306.

2 WHO.腫瘤國際組織學新分類-腸道腫瘤組織學分型.診斷病理學雜志社，2000.12.

3 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準.中國癌癥雜志，1996，6:229-231.

4 Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cyoplasmic beta-catenin Accumulation as a Predictor of hematogenous metastamis in human coldrectal.Caneer.Oncology，2000，59:302-309.

5 Friedl P，Wolf K.Tumour-cell invasion and migration:diversity and escap mechanisms.Nat Rev Cancer，2003，3:362-372.

6 Pollard TD，Borisy GG.Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.Cell，2003，112:453-65.

7 Yamashiro-Matsumura S，Matsumura F.Intracellular localization of the 55-kD Actin-bundling Protein in cultured cells:spatial relationships with actin，alpha-actinin，tropomyosin，and fimbrin.J Cell Biol，1986，103:631-640.

8 Tao YS，Edwards RA，Tubb B，et al.Beta-catenin associates with the actin-bundling protein fascin in a noncadherin complex.J Cell Biol，1996，134:1271-1281.

9 Okada K，Shimura T，Asakawa K，et al.Fascin expression is correlated with tumor progression of extrahepatic bile duct cancer.Hepatogastroenterology，2007，54:17-21.