CXCR4、HPA在非小細胞肺癌組織中的表達及意義

姚繼方 王明正 王朋

腫瘤轉移是由諸多因素決定的多步驟、序貫性的生物學過程，它涉及腫瘤細胞的運動、遷移、粘附、侵襲、生長、新血管生成、逃避免疫等幾個關鍵步驟，但具體機制仍不清楚。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌80%以上，很多患者就診時已經發生了遠處轉移，轉移是影響NSCLC患者5年生存率的重要因素，也是導致患者死亡的重要原因。近年來，趨化因子及其受體所介導的腫瘤轉移“歸巢”信號機制的提出，豐富和發展了Paget的“種子與土壤”學說，研究發現，趨化因子及其受體所介導的腫瘤特異性器官轉移主要是通過基質細胞衍生因子(SDF-1)/趨化因子受體-4(CXCR4)通路實現的［1，2］。乙酰肝素酶(HPA)是體內唯一可以水解細胞外基質和基底膜中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內切酶，研究發現HPA活性增強與多種腫瘤轉移有關［3，4］。本研究采用免疫組化的方法，通過對NSCLC手術切除標本檢測CXCR4、HPA的表達，并與正常肺組織進行對比，結合患者臨床病理資料，探討CXCR4、HPA在NSCLC中發生發展的關系，為判斷NSCLC的生物學行為提供參考指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年3至12月在河北醫科大學第四醫院胸外科行手術切除的NSCLC組織標本52例，同時取20例正常肺組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)標本作為對照。所有標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續切片，HE染色后經病理學檢查證實。所有病例均無術前化療、放療治療史。其中男42例，女10例;年齡40～74歲，平均年齡62.40歲;鱗癌22例，腺癌17例，腺棘細胞癌10例，粘液表皮樣癌2例，透明細胞癌1例;無淋巴結轉移26例，淋巴結轉移26例;臨床分期采用國際抗癌協會(UICC)2009年公布的NSCLC TNM分類分期標準:Ⅰ與Ⅱ期29例，Ⅲ與Ⅳ期23例。

1.2 試劑與方法 兔抗人CXCR4單克隆抗體購自Abcam(Hong Kong)公司，兔抗人HPA單克隆抗體購自SANT CRUZ生物技術公司，即用型Biotin SP-HRP免疫組化染色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，濃縮型DAB試劑盒購自中國中杉金橋試劑公司。采用免疫組織化學S-P法，按試劑盒說明書進行操作。

1.3 結果判定 CXCR4、HPA陽性染色定位于細胞漿，以胞漿內出現均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽性細胞。參照Andre等［5］評分標準，隨即選取5個高倍視野(×400)計數腫瘤細胞總數和陽性細胞數，得出陽性細胞百分率，采用半定量的方法進行，根據免疫組化染色陽性腫瘤的比例和染色強度進行評分:無陽性細胞0分，＜10%1分，10% ～50%2分，＞50%3分;無著色0分，輕度著色(淺黃色)1分，中度著色(棕黃色)2分，重度著色(棕褐色)3分。將上述兩項得分相加:＜3分為陰性(－)，≥3分為陽性(+)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，兩變量之間的分析采用Spearman等級相關分析，采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織和正常肺組織中 CXCR4的表達 52例NSCLC組織中CXCR4陽性表達率為63.46%(33/52)，20例正常肺組織中CXCR4陽性表達率為15%(3/20)，前者明顯高于后者，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。在NSCLC組織中，CXCR4與患者性別、年齡、腫瘤組織學類型、分化程度無關(P＞0.05)，而與淋巴結轉移、腫瘤 TNM分期有關(P＜0.05)，有淋巴結轉移組CXCR4表達明顯高于無淋巴結轉移組(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組CXCR4表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(P ＜0.05)。見表 2。

表1 CXCR4，HPA在正常肺組織和NSCLC組織中的表達例(%)

2.2 NSCLC組織和正常肺組織中HPA的表達 52例NSCLC組織中HPA陽性表達率為55.77%(29/52)，20例正常肺組織中HPA陽性表達率為10%(2/20)，前者明顯高于后者，有統計學意義(P＜0.01)。見表1。在NSCLC組織中，HPA與患者性別、年齡、腫瘤組織學類型、腫瘤分化程度無關(P＞0.05)，而與淋巴結轉移、腫瘤TNM分期有關(P＜0.05)，即有淋巴結轉移組HPA表達明顯高于無淋巴結轉移組(χ2=9.433，P＜0.01)，Ⅲ、Ⅳ組 HPA 表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(χ2=5.504，P＜0.05)。見表2。

表2 CXCR4，HPA在NSCLC組織的表達與臨床病理特征的相關性例

2.3 用Spearman等級相關分析CXCR4、HPA兩者之間表達的相關性 CXCR4、HPA在NSCLC組織中的表達經Spearman等級相關分析，兩者表達呈顯著正相關(r=0.289，P=0.038)。見表3。

圖2 HPA在NSCLC組織中的表達(SP×400)

圖1 CXCR4 NSCLC組織中的表達(SP×200)

表3 CXCR4與HPA兩表之間表達的相關性 例

3 討論

近年來肺癌的發病率不斷上升，每年約有110萬人死于肺癌［6］。復發和轉移是導致患者死亡的重要原因，也是影響患者5年生存率的重要因素，腫瘤轉移是一個非隨機的、高度組織器官選擇性的生物學過程，近年來研究發現趨化因子及其受體在腫瘤器官特異性轉移中發揮重要作用［7］。Muller等［8］報道，乳腺癌細胞系、乳腺癌原發灶及轉移灶高表達CXCR4，在乳腺癌最常見的轉移部位高水平地表達其配體SDF-1，CXCR4與SDF-1結合可引起乳腺癌細胞內骨架蛋白的聚合與再分布，調節細胞的運動和遷移。Ottaiano等［9］對結直腸組織的研究發現，CXCR4的表達在正常黏膜、結腸息肉組織、結直腸癌組織中呈逐漸上升趨勢，并且結直腸癌組織及結直腸癌伴肝轉移者CXCR4的表達均為高表達，結直腸癌及發生肝轉移的結直腸癌CXCR4表達顯著高于正常組織。到目前為止，已經發現CXCR4至少在23種不同類型腫瘤中均有表達，是腫瘤細胞表達最為普遍的趨化因子受體，并且和患者的預后相關［10］，研究者推測高表達CXCR4的腫瘤細胞，可能在SDF-1趨化、牽引下，逆濃度梯度轉移至作為配體產生源的某些器官，從而形成器官特異性轉移［11，12］。

腫瘤細胞要實現侵襲和轉移，必須穿過由細胞外基質和基底膜構成的屏障。糖氨聚糖是基底膜與細胞外基質的重要組成部分，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，HPA是一種可以特異性降解HSPG中糖鏈的內切酶，近年來研究發現HPA過表達與腫瘤的轉移潛能具有相關性，并可能影響患者的預后。Han等［13］用免疫組織化學的方法發現79例食管癌切除標本中有52例HPA表達陽性，腫瘤組織中HPA的表達比癌旁組織和正常組織中明顯增高，并且與腫瘤的浸潤深度、臨床分期和淋巴結轉移呈正相關。Vlodavsky等［14］檢測了不同轉移潛能腫瘤細胞中HPA的活性，發現高轉移潛能腫瘤細胞中HPA活性比低轉移潛能腫瘤細胞中高4～10倍，將HPAcDNA導入無轉移潛力的鼠淋巴瘤細胞及低轉移潛力的黑色素瘤，這些細胞獲得了高轉移潛能。Parish等［15］采用乙酰肝素酶抑制劑后，淋巴結轉移率降低約40%，腫瘤周圍血管減少了30%，證實了HPA具有促進新生血管生成、促進腫瘤細胞轉移的作用。

蘇麗萍等［16］研究認為肺癌的侵襲轉移在某種程度上是由于XCR4、SDF-1的相互作用導致，CXCR4、SDF-1的相互作用可以觸發與腫瘤轉移有關的多個事件的發生，如腫瘤細胞的侵襲能力、腫瘤細胞的運動能力、與血管內皮的黏附能力等。HPA可以裂解連接于細胞外基質和基底膜的重要組成成分，破壞其完整性，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此我們推測CXCR4與HPA之間可能存在相關性，為此我們檢測了NSCLC組織中CXCR4、HPA的表達，發現NSCLC組織中CXCR4、HPA的表達與正常肺組織相比，NSCLC組織中高水平表達CXCR4、HPA，為了進一步探討CXCR4、HPA在NSCLC組織中高表達的臨床意義，我們分析了CXCR4、HPA在NSCLC組織中的表達和患者臨床特征之間的關系，初步研究結果顯示CXCR4、HPA的表達與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、組織學類型無明顯關聯，而與淋巴結轉移、TNM分期相關，CXCR4陽性表達與HPA陽性表達呈正相關，提示CXCR4與HPA可能共同參與NSCLC的侵襲和轉移過程。

綜上所述，CXCR4、HPA在NSCLC組織中高表達，提示兩者可能共同參與NSCLC的侵襲和轉移，聯合檢測CXCR4、HPA有助于判斷NSCLC的轉移潛能和患者的預后，可能為NSCLC的治療提供新的分子靶點和策略。

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