流式細胞術分析與評價酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力

汪清美，陳慶森*

流式細胞術分析與評價酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力

汪清美，陳慶森*

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

研究傳統酸奶菌種對人體胃酸和膽汁鹽的耐受性，對評價酸奶的益生性具有重要意義。實驗選取普通酸奶中的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌作為研究對象，模擬胃腸環境以探討所選兩種菌株在不同pH值和不同質量濃度脫膽鹽下的耐受力，用流式細胞儀(FCM)結合羧基熒光素二醋酸酯(5-(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA)和碘化丙錠(propidium iodide，PI)兩種熒光染料評價其活力。結果表明：pH2.0時，菌體細胞活性較低，其活細胞標記率僅為41.8%，在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時，活細胞標記率越來越高，對其抑制性的影響逐漸減弱；在1g/100mL的脫膽鹽(DBS)中，活細胞標記率為48.7%，而在0.5、0.25、0.1、0.05g/100mL的DBS中時，活細胞的標記率越來越高；同時比較FCM與平板菌落計數法檢測菌體細胞的耐受水平。實驗證實酸奶菌種能耐受pH值為5.0～7.0的胃酸和0.05～0.5g/100mL的DBS；FCM檢測的菌體細胞的狀況更能恰當地反映發酵酸奶品質的優劣。

酸奶菌種；pH值；脫膽鹽；胃酸；活細胞；標記率

近幾年，隨著人們養生、健康、安全意識的逐漸增強，微生物功能制劑及功能食品市場十分活躍，品種也越來越多。但具有益生功能的微生物在人體內的存活能力強弱直接關系到其對人體養生、健康促進作用的正常發揮，也是檢驗產品質量的關鍵指標之一。

在乳酸菌家族中，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus

b u l g a r i c u s)、嗜熱鏈球菌(S t r e p t o c o c c o u s thermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)等是重要的有益菌，具有維持宿主微生態平衡、抑制腸道病源菌生長、降低膽固醇及緩解乳糖不耐癥等作用[1-2]。早在20世紀初，俄國科學家伊里亞·梅契尼可夫就提出了保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcous thermophilus)的益生效果，盡管這些有益菌對人體健康的作用眾所周知，但是其在胃腸道內的抗逆性較差，能否順利通過胃到達小腸，以及遠端的結直腸，其對酸、膽汁鹽的耐受能力是一個關鍵因素。據報道[3]，胃液pH值因飲食結構不同而波動很大，通常pH值為3.0左右，空腹或食用酸性食品時pH值可達1.5，食用堿性食物pH值可達4.5，食物通過時間為1～2h。十二指腸中膽汁鹽含量為0.3～3g/kg，食物通過的時間相對極短，可見胃腸為高酸高膽汁鹽環境。Gilliland等[4]把0.3mg/mL膽汁酸鹽質量濃度作為篩選耐膽汁酸鹽菌體的標準，Erkkia等[5]通過實驗也得到同樣的結論。

從概念上來說，菌的活性評價包括兩個指標：繁殖力(reproductive capacity)和存活力(viability)。活菌能否定植并存活是活菌制劑發揮益生作用的關鍵，這種定植存活過程取決于活菌能否抵御體內的不良環境(低pH值和高膽汁酸鹽)及是否具有能附著于胃腸道的黏附能力，而前者又是前提[6]。傳統測定細菌耐酸耐膽鹽的方法是活菌計數法和濁度法，平板菌落計數法能直接說明哪些菌株具有可培養性，但那些“活的非可培養”細菌檢不出；濁度法檢測的是細菌繁殖的情況，但不能定量，這兩種傳統的方法不僅耗時，而且結果不夠精確。對菌體的活性評價和普通微生物分析一樣，也應作為一個基本可靠的方法，并且這個方法必須快速精確，而流式細胞術(FCM)作為一門技術已成為檢測細菌活性快速而較好的方法。Diaper等[7]通過FCM結合cFDA成功地檢測了一系列具有脂酶活性的細菌培養液。酸奶菌種能否順利通過胃腸環境是決定其發揮功能特性的關鍵因素。本實驗選取普通酸奶中兩種菌株(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)作為研究對象，模擬人體胃腸環境，考察其在不同pH值和不同濃度脫膽鹽(deconjugated bile salts，DBS)的條件下這兩種菌株的耐受性，為人們評價酸奶對人體的益生作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

保加利亞乳桿菌1.1480(Lactobacillus bulgaricus 1.1480，L.b)、嗜熱鏈球菌6038(Streptococcus thermophilus6038，S.t)由中國工業微生物菌種保藏中心提供；MRS肉湯培養基、MRS固體培養基。

1.2 試劑與儀器

羧基熒光素二醋酸酯(5(6)-cFDA) Invitrogen公司；碘化丙錠(PI) Sigma公司；0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(PBS)，pH值分別調為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，用0.2μm的膜過濾，4℃保存待用；DBS(膽酸鈉和脫氧膽酸鈉按質量比1:1配制)；二甲基亞砜(DMSO)等。

FACSCalibur型流式細胞儀(雙激光配置) BD公司；ECLIPSE E200普通光學顯微鏡、血球計數板；熒光顯微鏡 日本Nikon公司；3k15生化離心機 Sigma公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體細胞的獲取

L.b1.1480和S.t6038菌株于初始pH值為6.0的MRS肉湯培養基中4 0℃發酵培養；作出生長曲線，取OD620nm=0.7的發酵液，4℃、4000×g離心10min，采用差速離心法，用PBS反復洗脫兩次，于4℃冰箱保存備用。

1.3.2 菌體細胞的前處理

1.3.2.1 對照組細胞樣品

一份200μL細胞樣品，于4℃冰箱保存待用作為對照組陽性管；另一份200μL細胞樣品，于70℃熱處理10min，在4℃冰箱保存待用作為對照組陰性管。陽性管和陰性管中的細胞樣品在上流式之前調細胞濃度為1.0×106個/mL。

1.3.2.2 酸處理細胞樣品

取6等份200μL細胞樣品，分別用pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的PBS于37℃條件下孵育60min于4℃冰箱保存待用，上流式之前調細胞濃度為1.0×106個/mL。

1.3.2.3 脫膽鹽處理細胞樣品

取5等份200μL細胞樣品，分別加到1.0、0.5、0.25、0.1、0.05g/100mL的DBS中，在37℃條件下孵育60min，于4℃冰箱保存待用，上流式之前調成菌體細胞濃度為1.0×106個/mL。

1.3.3 熒光標記

1.3.3.15 (6)-cFDA單標記菌體細胞

對1.3.2節處理的細胞樣品加20μL的cFDA，在暗室中操作，混合均勻后在避光的條件下3 0℃孵育10min，對cFDA標記的細胞懸液4000×g離心10min，去上清，沉淀細胞用等體積的PBS重新懸均勻，于4℃條件下保存待測。

1.3.3.25 (6)-cFDA/PI雙標記菌體細胞

將1.3.2節的細胞樣品加入20μL cFDA和15μL PI，整過操作過程在暗室中進行，標記好的細胞在避光條件

下30℃孵育10min，對cFDA標記過的細胞4℃、4000×g離心10min，去上清，用等體積的PBS重新懸浮沉淀細胞，懸均勻，于4℃條件下保存待測。

1.3.4 FCM檢測細胞活性

將1.3.3節得到的細胞4℃恒溫保存上流式細胞儀檢測。在上流式細胞儀前，待測細胞樣品懸均勻。FCM檢測光源為氬離子激光，氬離子激發光波長488nm，發射光光波長大于630nm，檢測器FL1檢測波長530nm，檢測器FL3檢測波長670nm，每個樣品收集3×104個細胞。以未進行標記的菌懸液為陰性對照，以前向散射角(FSC)和側向散射角(SSC)設“門”，圈定待檢測的目標細胞；cFDA和PI這兩種熒光染料分別用來檢測活細胞和死細胞，cFDA走FL1熒光通道，而PI走FL3熒光通道，根據需要設定不同的參數組合。

1.3.5 平板菌落計數法

對1.3.2節處理得到的細胞樣品用無菌PBS進行梯度稀釋，于MRS固體平板上37℃培養48h后，進行菌落計數并與FCM結果做比較。

1.4 數據處理

采用CELL Quest program 6.0和Origin6.0軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 菌體細胞5(6)-cFDA單標記和5(6)-cFDA/PI雙標記對檢出效果的作用

2.1.15 (6)-cFDA單標記菌體細胞對檢出效果的作用

圖1 5(6)-cFDA單標記菌體細胞Fig.1 Cell suspensions stained with 5(6)-cFDA

在圖1A中，cFDA標記的菌體細胞與自發熒光的細胞群在空間上分群不明顯，大部分自發熒光的細胞在陰性區；圖1B整個細胞群體成一體，待檢測的目標細胞群與其他顆粒細胞不分群，在空間上無法準確圈定目標細胞來分析。圖1C與圖1B是同一細胞樣品，采用柱狀圖來分析，出現兩個峰，且峰圖較寬，致使cFDA標記上的活細胞群與死細胞及其細胞顆粒分不開。由圖1可知，采用cFDA單標記法在FCM圖中無法分開活細胞與死細胞群，因此，單標記測定細胞活性無法得到準確的結果。

2.1.2 菌體細胞5(6)-cFDA/PI雙標記對檢出效果的作用

圖2 5(6)-cFDA/PI雙標記菌體細胞的結果Fig.2 Double labeling of cell suspensions stained with 5(6)-cFDA and PI

圖2A顯示菌體細胞暴露在pH2.0的PBS液中，41.2%的菌體細胞死亡，相應地被cFDA標記上的活細胞為59.8%；圖2B中，PI和cFDA標上的死細胞和活細胞在空間上能明顯地分開，通過圈圖統計分析可得出被PI和cFDA標記上的死細胞和活細胞率；圖2C中，在pH7.0時，幾乎所有的細胞被cFDA標記上，一些自發熒光的細胞在空間也可區分。所以，雙標記法在流式圖中更易區分死細胞和活細胞群體，而且標記的結果更精確。

2.2 模擬胃腸環境評價傳統菌種細胞的生存力

2.2.1 酸處理對菌體細胞活性的影響

按照1.3.3.2節標記細胞的方式分析檢測傳統酸奶中菌種細胞對胃酸的耐受性，結果見圖3。

圖3 不同pH值的酸處理對菌體細胞的影響Fig.3 Effect of pH on viability of suspended cells

由圖3可知，菌體細胞在pH2.0的PBS中孵育60min后，菌體細胞耐受性較低，活細胞被cFDA標記且標記率為41.8%，在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，對菌株細胞的抑制力越來越低，相應地活細胞的標記率隨pH值的增大而增高，其活菌數不斷上升，菌株呈正常生長態勢，且在整個處理期間，活菌數變化不大，說明pH值在5.0～7.0內對菌體細胞的存活抑制較小。

2.2.2 脫膽鹽處理對菌體細胞活性的影響

小腸中膽汁鹽對菌體細胞有較大的影響，按照1.3.3.2節的方式模擬人體胃腸環境標記菌體細胞，檢測其對不同終質量濃度脫膽鹽的耐受性，結果見圖4。

圖4 不同終質量濃度的脫膽鹽對菌體細胞的影響Fig.4 Effect of deconjugated bile salt concentration on viability of suspended cells

由圖4可知，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這兩種菌的菌體細胞暴露在0、0.05、0.1、0.25、0.5g/100mL的DBS下，菌體細胞活性發生不同程度的變化。圖4A為保加利亞乳桿菌菌體細胞在不加DBS的情況下，99.1%的菌體細胞被cFDA標記，隨著DBS在菌體細胞中終質量濃度的增加，標記率越來越低。0.05g/100mL的DBS對乳酸菌菌體細胞無明顯抑制作用，隨著膽酸鹽質量濃度的提高，對乳酸菌的抑制作用逐步加強。當菌體細胞在0.5g/100mL的DBS中，部分菌體細胞表現無活性，相應地平板上的菌體細胞生長都很微弱。1g/100mL的DBS對這兩株菌種細胞表現明顯的抑制作用(圖4未顯示)。顧瑞霞等[8]研究的結果是保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌能耐受0.2～0.7g/100mL的DBS，本研究結果與此基本相一致。

圖4F～J為菌體細胞暴露在0、0.05、0.1、0.25、0.5g/100mL的DBS后被PI標記的結果，其結果與cFDA標記的結果相對應。

2.3 發酵酸乳菌種基于FCM和平板菌落計數法檢測效果的比較

傳統檢測菌體細胞活性的方法是平板菌落計數法和濁度法等，但這些方法既費時又費力，且結果不精確。比較FCM和平板菌落計數法對酸乳菌種活性的檢測效果，其結果見圖5。

圖5為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在不同質量濃度的脫膽鹽中孵育后于MRS固體平板上培養，其計數結果與FCM-cFDA/PI標記結果的比較，cFDA/PI標記的結果略高于平板計數結果；同樣，在不同pH值下的菌體細胞，FCM計數的結果高于平板菌落計數法(結果未顯示)。與傳統方法相比，FCM方法檢測傳統酸乳菌種活性有諸多優勢。平板菌落計數法耗時長(通常需要48h)，數據離散程度高。在本研究中發現，同時使用平板菌落計數法和FCM方法檢測同樣的菌液細胞，因

細菌在平板上生長過程中易受許多外界因素影響，有時并不能準確地反映菌液中活菌數的比例關系。與之相比，FCM方法取樣和染色操作簡便、耗時短，完成整個檢測過程僅需1h左后即可獲得準確可靠的數據。

圖5 FCM和平板菌落計數法檢測酸乳菌種對脫膽鹽的耐受性的比較Fig. 5 Comparison of tolerance of yogurt strains to bile salt evaluated by flow cytometry and plate counts

3 討 論

羧基熒光素二醋酸酯(5-(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA)是一種具有酯酶熒光底物的染料，已廣泛應用于細菌的活性分析中。5(6)-cFDA具有細胞滲透性，通過胞內非特異性脂酶水解二醋酸鹽(DA)生成羧基熒光素(fluorescent carboxyfluorescein，cF)[9]，在藍色光激發下發出綠色熒光。部分菌體細胞自身在激光激發下，能發出較弱的自發熒光，自發熒光在波長530nm左右被FL1檢測器檢測；被5(6)-cFDA染色的活細胞在530nm波長附近發出很強的綠色熒光，但死細胞因不能被5(6)-cFDA標記故不能被檢測出，通過在FCM圖譜上比較熒光強度的差異，就可以將活細胞與死細胞區分開來，但問題是菌體細胞的自發熒光在波長530nm左右也被檢出，所以，cFDA單標記易造成假陽性結果。

cFDA/PI這兩種熒光染料結合FCM來檢測菌體細胞的存活力之所以應用廣泛，是因為所有標記上的細胞群在空間上易區分。在流式的FL1-H/FL3-H的散點圖中，因cFDA和PI的激發光譜不同，cFDA和PI標記的細胞亞群能在空間分開；在直方圖中，當未被標記上的細胞或一些自發熒光的細胞與cFDA/PI標記上的細胞在峰圖中有較高的重疊時，通過圈定散點圖中的活/死細胞群，在直方中得到較好的圖譜。

4 結 論

本研究發現，菌種細胞在pH值為2.0的PBS中孵育后，對菌體細胞活性有明顯的抑制，FCM圖譜中標記率只有59.12%，在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0時抑制率明顯下降，并且在6.0、7.0時抑制率幾乎為零，在pH7.0時和對照組幾乎無差別，說明大部分菌體細胞能耐受pH值為5.0～7.0的環境。DBS在0.05～0.5g/100mL時菌體細胞的活性表現較高，而在1g/100mL的脫膽鹽條件下，標記率只有不到30%，說明1g/100mL的脫膽鹽明顯抑制了細胞的活性。通過酸奶菌種對酸、脫膽鹽耐受性的研究，發現在pH值在5.0～7.0、脫膽鹽在0～0.5g/100mL內，酸奶菌種細胞活性受抑制較小。實驗過程還發現菌體細胞濃度在104～106個/mL范圍內，在FCM的檢測中能將活性細胞和無活性細胞清楚地分開，并能正確反映其比例關系。

通過酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力的分析，可以得出傳統酸奶菌種在食入人體胃腸后對胃酸和膽汁鹽的耐受力并不是很高，李偉等[10]曾較全面地介紹了酸奶的演變過程以及在發酵食品中的重要地位，因此，提高發酵酸乳中有益菌在腸道中的活性以及活性分析、穩定性的鑒定至關重要。

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Tolerability of Yogurt Strains to Mimic Gastric Acid and Bile Salt as Analyzed by Flow Cytometry

WANG Qing-mei，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Studies on the tolerability of traditional yogurt strains to gastric acid and bile salt are very important to evaluate probiotic strains in yogurt. The Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in yogurt were evaluated for their tolerance to different pH and different concentrations of bile salt in mimic gastrointestinal environment using flow cytometry (FCM) combined with double-fluorescence dye staining by 5(6)-cFDA and PI. The cell viability was very small, and the percentage of labeled viable cells was only 41.8% at an exposure pH of 2.0 and became higher and higher as the exposure pH increased from 3.0 to 7.0 (3.0, 4.0 through 7.0), and the inhibitory effect on viable cells showed a progressive reduction. The percentage of labeled viable cells exposed to 1 g/100mL deconjugated bile salt (DBS) was 48.7%, and those of labeled viable cells exposed to 0.5 g/100mL, 0.25 g/100mL, 0.1 g/100mL and 0.05 g/100mL DBS displayed an increasing pattern. Flow cytometry and plate counts were comparatively used to determine cell viability. The above two species of strains exhibited strong tolerance at the conditions of pH 5.0－7.0 gastric acid and 0.05－0.5 g/100mL deconjugated bile salt. Flow cytometry count was superior to plate count.

yogurt strain；pH；deconjugated bile salt；gastric acid；living cell；percentage of labeled cells

R446.61

A

1002-6630(2010)21-0384-06

2010-07-17

國家自然科學基金項目(30771524)

汪清美(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術。E-mail：wanghan812819@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn