乳源酪蛋白糖巨肽改善小鼠潰瘍性結腸炎的研究

賈玉臣，陳慶森*

乳源酪蛋白糖巨肽改善小鼠潰瘍性結腸炎的研究

賈玉臣，陳慶森*

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

利用惡唑酮復制小鼠潰瘍性結腸炎(UC)以研究乳源酪蛋白糖巨肽(CGMP)對潰瘍性結腸炎的影響。空白對照組小鼠僅飼喂普通鼠食，模型對照組與3個CGMP組灌注惡唑酮誘導潰瘍性結腸炎，誘導建模后對3個CGMP組小鼠分別灌胃低、中、高劑量的CGMP(劑量分別為5、50、500mg/(kg bw·d))，連續灌胃5d。期間記錄小鼠每天體質量變化，末次灌胃后檢測小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)活性以及結腸中髓過氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量，并觀察結腸組織形態。結果表明：低、中、高劑量CGMP均可在一定程度上改善惡唑酮誘導的小鼠潰瘍性結腸炎病癥，尤其以中劑量CGMP的作用較為明顯，因此證實CGMP作為一種營養手段調理潰瘍性結腸炎具有很好的前景。

酪蛋白糖巨肽；CGMP；惡唑酮；潰瘍性結腸炎

Delfour 等[1]于1965年在乳κ-酪蛋白中發現了含有唾液酸的多肽。牛乳中的κ-酪蛋白在凝乳酶作用下，105位Phe至106位Met之間的肽鍵斷裂，分成兩部分：不溶性的副酪蛋白(肽鏈的1～105部分)和可溶性的親水多肽(肽鏈的1 0 6～1 6 9部分，稱為酪蛋白巨肽，caseinomacropeptide，簡稱為CMP)。其中，有30%～50%的CMP是以糖基化的形式存在的，稱為酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)。因CGMP特殊的氨基酸組成，即不含芳香族氨基酸，在280nm波長處沒有紫外吸收，所以，它可作為苯丙酮酸尿癥(PKU)患者的膳食首選。此外，CGMP還有諸多其他的生物活性，比如抗微生物毒素[2]、促益生菌增殖[3]以及免疫調節[4]等活性，目前已有許多研究陸續地對CGMP的免疫調節作用進行了初步探索[5]，但國內關于其調

理、改善和治療潰瘍性結腸炎(UC)病癥的研究還未見相關報道。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是指腸道的一種慢性復發性炎癥，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn s disease，CD)。其中潰瘍性結腸炎因其病因未明，傳統藥物療效不甚理想，至今還沒有理想的治療方法[6]，開發一種有效的營養治療方案一直是該領域的研究熱點。本研究應用惡唑酮(OXZ)復制UC模型，初步研究CGMP對OXZ誘導小鼠結腸炎的治療效果，從CGMP對模型小鼠的體質量、結腸炎的3項氧化損傷指標、大體形態損傷評分以及病理組織形態的影響這4個方面進行對CGMP在腸道中的抗炎活性進行探討，以揭示CGMP可能在一定程度上調理或改善UC病癥效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Balb/c小鼠(SPF級，雄性，體質量(25±2)g)、小鼠常規飼料購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

CGMP 新西蘭Tatua公司；惡唑酮 Sigma公司；二胺氧化酶(DAO)檢測試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精染液、伊紅染液 天津市久圣醫療電子儀器有限公司；中性樹膠和切片用軟、硬石蠟 上海標本模型廠；其他常規試劑均為國產分析純。

紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；電熱恒溫干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；石蠟切片機、生物組織攤片機、生物組織烤片機 金華市益迪醫療設備廠；倒置顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

Balb/c小鼠40只，適應性喂養一周，每組8只，隨機分為5組：正常對照組、模型對照組、低劑量CGMP組(5mg/(kg bw·d))、中劑量CGMP組(50mg/(kg bw·d))和高劑量CGMP組(500mg/(kg bw·d))。

1.2.2 UC模型制作[7]

禁食不禁水24h后，將硅膠管從肛門插入模型對照組、低劑量CGMP組、中劑量CGMP組和高劑量CGMP組小鼠腸道深約4cm注射，正常對照組組灌注50%乙醇作為對照，模型組與3個CGMP組均灌注1%OXZ(OXZ溶于50%乙醇)，灌腸后對3個CGMP組小鼠灌胃相應劑量的CGMP，正常對照組與模型組僅飼喂普通鼠食，此記為第1天處理，連續灌胃5d。

1.2.3 觀察指標

每天觀察小鼠狀態(精神、活動、飲食量等)，測定所有小鼠的體質量變化情況，并作詳細記錄。

1.2.4 血清中DAO活性的檢測

末次灌胃后對所有小鼠進行眼眶靜脈取血，分離血清，利用DAO試劑盒測定小鼠血清中DAO活性，具體操作依據試劑盒說明書進行。

1.2.5 大體形態損傷評分及結腸組織中MPO活性和MDA含量的測定

頸椎脫臼法處死所有小鼠，打開腹腔，剪取結腸段，對明顯病變處進行大體形態損傷評分，評分標準如表1所示[8]。

表1 大體形態損傷評分表Table 1 Criteria for evaluation of visible lesions in mouse colon

將結腸置于預冷處理的玻璃組織勻漿器內制得5%結腸組織勻漿，利用MPO試劑盒和MDA試劑盒分別測定小鼠結腸中MPO的活性和MDA的含量，具體操作依據試劑盒說明書。同時取1cm病變結腸于4%甲醛中固定24h，先經梯度濃度的乙醇脫水處理，二甲苯透明后，石蠟包埋，將已固定好的組織石蠟塊切成5μm切片，貼于防脫載玻片上經展片、烤片處理，然后脫蠟復水，蘇木精染色15min，1%鹽酸分化15s并脫水后，置于伊紅染液中染色2min，中性樹膠封片后以供病理組織學觀察。

1.2.6 統計學處理

所有實驗數據利用SPSS11.5統計軟件，進行單因素方差分析，處理結果用平均值±標準差(x±s)表示。

2 結果與分析

2.1 CGMP對小鼠一般狀態及體質量變化的影響

實驗期間，OXZ模型小鼠明顯表現為食量減少，毛發松散、無光澤，少動且有不同程度的腹瀉，肛部黏連；而正常對照組小鼠表現為飲食正常，毛發有光澤， 3個CGMP組的小鼠除前2d有腹瀉反應外，與正常對照組相比其飲食差異不大。CGMP對3組小鼠體質量變化的影響結果見表2。

表2 CGMP對小鼠體質量變化的影響及其與對照組的比較(n=8)Table 2 Effect of CGMP on body weight of mice (n=8)

由表2可見，正常對照組小鼠在實驗期間體質量明顯增加，而OXZ模型小鼠的體質量一直呈現下降趨勢，從第4天開始體質量下降超過了10%，兩組之間的差異極其顯著；低劑量和中劑量CGMP組小鼠在灌注OXZ兩天內也呈現體質量下降趨勢，且與正常對照組相比差異極其顯著，但下降幅度比OXZ模型組小鼠較小，而且第4天和第5天開始出現體質量增加，與OXZ模型組差異極其顯著。高劑量CGMP組小鼠的體質量一直呈下降趨勢，雖然期間一直與正常對照組差異極其顯著，但下降幅度比OXZ模型對照組小鼠小。

2.2 CGMP對小鼠MPO活力、MDA含量及DAO活力的影響

MPO活力、MDA含量及DAO活力可以準確反應結腸的氧化損傷程度，本研究中CGMP對小鼠MPO活力、MDA含量及DAO活力的影響見表3。

表3 CGMP對小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量的影響(n=8)Table 3 Effect of CGMP on DAO and MPO activities and MDA content in mice (n=8)

由表3可見，OXZ模型組小鼠血清中的DAO活力與正常對照組差異極其顯著，低劑量CGMP組差異不顯著，中、高劑量CGMP組均比模型組顯著降低，與正常對照組差異不顯著；OXZ模型組小鼠結腸中的MPO活力與正常對照組之間差異極其顯著，低、中、高劑量CGMP組比OXZ模型組顯著降低，但與正常對照組存在著差異；模型組結腸中MDA含量比正常對照組顯著升高，中劑量CGMP可顯著降低MDA含量，且與正常對照組差異不顯著，低、高劑量CGMP組與正常對照組和模型組均無顯著性差異。

2.3 CGMP對小鼠結腸大體形態損傷評分的影響

根據結腸大體形態損傷評分可以直接反映結腸的潰瘍程度，CGMP對小鼠結腸大體形態損傷評分的影響見表4。

表4 CGMP對小鼠結腸大體形態損傷評分的影響(n=8)Table 4 Effect of CGMP on visible lesions in mice colon (n=8)

由表4可見，OXZ灌腸形成結腸炎后模型組小鼠的結腸大體形態損傷指數比正常對照組顯著增高，低、中、高劑量CGMP均可顯著降低小鼠結腸的大體形態損傷指數，但與正常對照組還存在著一定的差異。

2.4 CGMP對改善UC模型小鼠結腸組織形態觀察結果各組小鼠結腸組織形態經放大40倍后的觀察結果見

圖1。

圖1 各組小鼠結腸病理組織切片(×40)Fig.1 Histological images of mice from 5 groups (HE Staining,×40)

各組小鼠結腸組織形態經放大100倍后的觀察結果見圖2。

圖2 各組小鼠結腸病理組織切片(×100)Fig.2 Histological images of mice from 5 groups (HE Staining,×100)

通過光鏡下小鼠結腸組織形態的照片(40倍和100倍)可以看出，正常對照組小鼠結腸結構清晰，上皮完整，杯狀細胞豐富，而模型組小鼠結腸壁明顯增厚，固有

層水腫，杯狀細胞丟失。低、中、高劑量C G M P組小鼠結腸與模型組相比，上皮較完整，與正常對照組相比，腸壁稍厚。

3 討論與結論

近年來，本實驗室以努力提高原料乳的附加值和綜合利用水平為宗旨，利用不同技術手段成功地從乳中分離純化出CGMP，并建立起了相應的成熟工藝路線[9-10]，為實現CGMP以及相關生物活性產物的產業化打下了堅實的基礎。目前，國內外有關CGMP的生物學活性以及功能特性有所報道，而CGMP與IBD相關的生物學功能報道較少，國內未見報道。本研究以IBD動物模型為對象，探索CGMP對OXZ誘導小鼠結腸炎的治療效果，該動物模型對研究利用OXZ誘導的小鼠結腸炎模型具有以下優點[7]：1)制模簡單，重復性好；2)模型動物易得，耗費較低；3)模型的組織學特征和炎癥分布均類似人類UC，可作為研究UC發病機制的有益工具；4)炎癥可持續2周左右可用于藥物療效的評估。雖然UC的發病原因至今尚不明確，但氧化損傷已被證實是其發病的一個重要機制，結腸組織的氧化損傷主要是由于氧自由基引起的。DAO是腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內酶，在組胺和多胺代謝中起作用，能夠反映腸道機械屏障的完整性和損傷程度。MPO是一種由中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞分泌的酶，與腸組織的氧化損傷呈典型的正相關[11]。MDA是脂過氧化反應的一種重要產物，可反映機體內自由基的積累，從而可以表征組織的氧化損傷。DAO、MPO與MDA可用來作為IBD病情活動臨床監測指標。本實驗結果表明，OXZ模型對照組小鼠的氧化損傷指標(DAO活力、MPO活力及MDA含量)均比正常對照組顯著升高，可見潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織具有顯著氧化損傷；實驗中，低劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中的MPO活力(P＜0.01)，中劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結腸炎小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，同時高劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結腸炎小鼠DAO活力和MPO活力(P＜0.05，P＜0.01)，由此可以得出結論，CGMP可通過在腸道中發揮抗炎活性來減輕潰瘍性結腸炎的病征。IBD發病時，腸黏膜屏障被破壞，而改善腸黏膜的屏障功能是治療IBD的一大目標[12]，腸黏膜上皮細胞相互連接是腸黏膜屏障的重要組成部分。本實驗從實驗動物結腸病理組織形態的研究結果還證實了CGMP可保持較完整的上皮細胞，從而有助于維持結腸組織形態的完整。灌胃低、中、高劑量CGMP在有效模型期內均可在一定程度上改善OXZ誘導的小鼠結腸炎，尤其以中劑量CGMP的作用較為明顯。由于OXZ誘導的小鼠結腸炎在短期內便可呈現最大病態，因此CGMP相對于藥物治療是作為一種營養方案使小鼠的炎癥在一定程度上加以改善。

有關IBD的發病機制的大量研究報道已證實是結腸組織的氧化損傷，本研究也證實CGMP對結腸組織的氧化損傷具有一定的改善和治療作用。近期IBD的發病機制已有從細胞因子、轉錄因子、腸道菌群等方面研究的報道，特別是CGMP對小鼠IBD改善、緩解、治愈的作用機制的研究。陳佳婕等[13]研究認為IBD患者腸黏膜免疫反應異常，NF-κB是參與調控腸道免疫炎性反應的關鍵因子之一。現已證明，許多IBD臨床治療用藥，如5-氨基水楊酸(5-ASA)、糖皮質激素、抑制性細胞因子等的藥理作用均與抑制NF-κB有關[14]。到目前為止，國內也有研究證實了P38MAPK信號傳導通路在結腸炎中的作用，并為UC的治療新藥提供實驗依據[15]。國外Requena 等[5]已經證實了CGMP具有激活NF-κB信號通路的作用，并認為bovine casein glycomacropeptide (BGMP)在腸道中可能起到抗炎的作用。

總之，本研究可以證實CGMP對OXZ誘導的小鼠UC具有顯著的改善和治療結腸組織氧化損傷的功能，研究結論提示乳源的生物活性肽是解決IBD常見、難愈疾病的一條可行的途徑。但CGMP的科學明確的抗炎活性機制還有待于后續從分子水平上研究解決。

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Improvement of Oxazolone-induced Ulcerative Colitis in Mice by Bovine Casein Glycomacropeptide

JIA Yu-chen， CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to explore the effect of casein glycomacropeptide (CGMP) on xazolone-induced ulcerative colitis in mice, the control group was fed regular diet, while the model group and three treatment groups were administered CGMP at three doses of 5, 50 mg/(kg bw·d) and 500 mg/(kg bw·d) by oral gavage for 5 days after oxazolone challenge. The change of body weight was daily recorded and diamine oxidase (DAO) activity in serum, myeloperoxidase (MPO) activity, malonaldehyde (MDA) content in colon, and histological change of colon were determined after the last administration. Treatments with the three doses of CGMP showed improvement on oxazolone-induced ulcerative colitis, while the dose of 50 mg/(kg bw·d) CGMP seemed to be better. In conclusion, CGMP holds promising potential to be applied in a nutritional therapy for the treatment of ulcerative colitis.

casein glycomacropeptide；CGMP；oxazolone；ulcerative colitis

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0365-04

2010-07-17

國家自然科學基金項目(30771524)

賈玉臣(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術、乳品質量與安全。E-mail：jychtotti@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、蛋白資源開發與應用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn