紫玉米成熟期以及不同干燥方式條件下花青素和兩種毒素的含量變化

肖麗霞，汪 芬，于洪濤，趙曉燕*，胡曉松

紫玉米成熟期以及不同干燥方式條件下花青素和兩種毒素的含量變化

肖麗霞1，汪 芬1，于洪濤1，趙曉燕2,*，胡曉松3

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100087)

建立高效液相色譜方法準確檢測紫玉米中富馬毒素B1和黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。在紫玉米成熟、不同干燥過程中監測苞葉、穗軸、籽粒三部分的毒素及花青素含量的變化情況，從而找到最佳的采收時間、最佳干燥方法。結果表明：從紫玉米種植開始，10周后為最佳采收時間；紫玉米苞葉中花青素含量最高且易干燥；微波干燥解毒能力強，但花青素損失較多且很難用于工業化操作；鼓風干燥適合用來干燥籽粒；日光干燥苞葉和穗軸花青素幾乎沒有損失，能降低50%左右的毒素，經濟適宜，適合工業化生產。

紫玉米；花青素；富馬毒素；黃曲霉毒素；干燥

紫玉米(Zea Mays L.)原產于南美安第斯山區，其籽粒和植株呈紫黑色，有“黑珍珠”之稱[1]，且富含天然色素——花青素?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、清除自由基、增強人體免疫力等生理功效，市場前景十分廣闊[2-3]。但是紫玉米生長、儲藏過程中極其容易受真菌感染而產生富馬毒素(FB1)和黃曲霉毒素(AFs)[4-5]，而AFs毒性是氰化鉀的10倍，為砒霜的68倍。國際癌癥中心將AFs定為一類致癌劑[6-7]，將FB1定為人類可能的致癌物[7]。在提取紫玉米花青素時，原料中的毒素會通過濃縮、純化等工藝進一步聚集，使花青素提取物中的毒素含量超標[8]，從而影響到從紫玉米中提取花青素的工業化推廣。本研究確定最佳的采收時期和適宜的干燥方式，使紫玉米中毒素的增長得到有效地控制，對紫玉米花青素的生產具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫玉米(苞葉、穗軸、籽粒)：北京市延慶農場2008年種植。

FB1標準品、AFs標準品(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2) 美國Sigma公司；巰基乙醇(分析純)、三氟乙酸(分析純) 北京索來寶科技有限公司；鄰苯二甲醛(分析純) 北京金龍化學試劑有限公司；乙腈、甲醇(均為色譜純) 迪馬科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DGU-20A5高效液相色譜儀(配RF-10AXL熒光檢測器)日本島津公司；C18反相柱 美國Waters公司；SUPELCO固相萃取裝置、TC-F120富馬毒素專用富集柱、PuriToxSR多功能凈化柱 北京銳鑫農科貿有限公司；DZQ-500型抽真空機 北京日上公司；UV-3802紫外分光光度計 美國Unic公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀 余姚長江溫度儀表廠；格蘭仕WD800型微波爐 順德格蘭仕電器廠有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 北京雅仕林實驗設備有限公司；ALPHA 2-4 LD凍干機 Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣

從紫玉米種植第8周起每隔一周去北京延慶農場紫玉米試驗田隨機采樣，包括苞葉、穗軸、籽粒，采樣6周。

1.3.2 干燥

對原料(未處理)分別采用不同方式進行干燥。日光干燥：將原料在日光下曬20h；鼓風干燥：將原料置于鼓風干燥箱中60℃干燥16h；微波干燥：將原料置于微波爐中，調至中擋，籽粒和穗軸烘烤10min，苞葉烘烤5min；真空低溫干燥：將原料在凍干機中凍干72h。各種干燥方式都要達到原料中的水分含量小于10%。

1.3.3 AFs標準曲線的繪制和檢測

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱溫：20℃；激發波長：360nm，發射波長：440nm；流動相：甲醇-乙腈-水體積比1:1:4，流速：1mL/min；衍生劑：三氟乙酸溶液(10mL三氟乙酸+5mL冰乙酸+35mL水)；進樣量：10μL。

1.3.3.2 AFs標準曲線的繪制

以1mL苯-乙腈(體積比98:2)溶解1mg AFB1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準品，將之分別配成1mL質量濃度分別為1.2、0.2、0.6、0.2μg/mL的標準品工作液，分別吸取90、180、270μL氮氣吹干后以10mL乙腈溶解，取其200μL與700μL衍生劑于液相進樣瓶混勻，60℃水浴下反應10min后進樣檢測。以AFs質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線[9-12]。

AFB1、AFG1、AFB2、AFG2的線性回歸方程分別是Y=3.0×106X－63.506(R2=0.9996，P＜0.05)、Y= 3.0×106X+78.036(R2=0.9998，P＜0.05)、Y=734300X+ 404.2(R2=0.9974，P＜0.05)、Y=940629X+161.86(R2= 0.9968，P＜0.05)；檢出限分別為0.005、0.003、0.001、0.0015ng/mL。

1.3.3.3 測定的精密度、準確度和重現性

測定4種毒素的加標回收率在84%～106%，平均回收率分別為95.7%、91.3%、99.8%、93.7%，平均變異系數分別為4.4%、3.1%、6.8%、3.7%，樣品檢測準確度和精密度好，日內變異系數和日間變異系數分別為2.8%和4.3%，說明方法的重現性好。

1.3.3.4 AFs的提取和測定

將干燥后的原料粉碎，過60目篩，稱取2g置于30mL乙腈-水(體積比9:1)的中，搖床振蕩1h后8000r/min離心20min，上清液過中性濾紙得AFs提取液，吸取3mL過PuriToxSR真菌毒素多功能凈化柱，得AFs凈化液[13]。取樣200μL衍生后進樣檢測，計算質量濃度(C)，毒力指數[14]計算公式為：

毒力指數=CAFB1+0.22CAFB2+ 0.5CAFG1+ 0.11CAFG2

1.3.4 FB1標準曲線繪制和檢測

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱溫：23℃；激發波長：335nm，發射波長：440nm；流動相：甲醇-0.1mol/L NaH2PO4(體積比78:22，磷酸調至pH3.3)，流速1mL/min；衍生劑：鄰苯二甲醛溶液(40mg OPA+1mL甲醇+5mL 0.1mol/L四硼酸鈉+50μL 2-巰基乙醇)；進樣量：20μL。

1.3.4.2 FB1標準曲線的繪制

以1mL乙腈-水(體積比1:1)溶解1mg FB1標準品，分別配成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL的標準品工作液，取樣50μL與200μL衍生劑漩渦混勻，3min內進樣檢測，以標準液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線[15-16]?；貧w方程為：Y=365961X+28412 (R2=0.9998，P＜0.05)，檢出限為0.1μg/mL。

1.3.4.3 測定的精密度、準確度和重現性

測定FB1的加標回收率在76%～82%，平均回收率為79%，平均變異系數為4.1%，樣品檢測的準確度和精密度好，日內變異系數和日間變異系數為3.5%和5.3%，說明檢測方法重現性好。

1.3.4.4 FB1的提取純化及檢測

將干燥后的原料粉碎，過60目篩，稱取2g置于30mL甲醇-水(體積比3:1)中，振蕩1h后8000r/min離心20min，取上清液過中性濾紙得FB1提取液，用1mol/L NaOH溶液調pH值至5.8～6.5待用[17-18]。依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3:1)溶液活化富馬毒素專用凈化柱，流速不超過1mL/min。吸取10mL FB1提取液過柱后，依次用5mL甲醇-水(3:1)，3mL甲醇淋洗，最后用10mL冰乙酸-甲醇(1:99)洗脫，收集洗脫液，60℃氮氣揮干。分析時用1mL乙腈-水(1:1)溶解，0.45μm有機溶劑濾膜過濾，取樣50μL衍生后進樣檢測。

1.3.5 花青素的提取測定方法

花青素的提?。哼x用乙醇溶劑，料液比為1:15(m/V)，65℃條件下提取40min?；ㄇ嗨氐臏y定：采用pH示差法[19]。

2 結果與分析

2.1 AFs的液相色譜圖

圖1 AFs標準品液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of aflatoxin standards

圖2 紫玉米中AFs液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of aflatoxins in purple corn

利用高效液相色譜法柱前衍生法，以三氟乙酸作為衍生劑，熒光檢測器檢測，得到液相色譜圖，其中未標示雜峰為溶劑峰。通過比較紫玉米的AFs和AFs標準品的液相色譜圖可知，AFB1、AFG1、AFB2、AFG2的保留時間分別為5.456、7.328、11.532、16.788min。AFB2未被檢測出，這與Muller的實驗結果一致[20]。

2.2 FB1液相色譜圖

圖3 FB1標準品液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of fumonisin B1standard

圖4 紫玉米中FB1液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of fumonisin B1in purple corn

利用高效液相色譜柱前衍生法，以OP A為衍生劑，熒光檢測器檢測，得到液相色譜圖，其中未標示雜峰為溶劑峰。通過比較紫玉米的FB1液相色譜圖和FB1標準品的液相色譜圖可知，FB1保留時間為7.652min。

圖5 采樣周期內花青素含量變化情況Fig.5 Change of anthocyanin in purple corn during the harvesting period

圖6 采樣周期內毒素含量變化情況Fig.6 Changes of toxins in purple corn during the harvesting period

圖7 采樣周期內AFB1含量變化情況Fig.7 Change of fumonisin B1in purple corn during the harvesting period

2.3 紫玉米在成熟期花青素與毒素含量的變化情況如圖5～7所示，采樣兩周后花青素質量分數增高約15倍，而毒素增加較為緩慢，成熟初期紫玉米生理活動旺盛，能產生較多花青素并抑制霉菌的生長。在成熟后期，花青素呈下降趨勢，可能是成熟后期紫玉米自身合成花青素能力下降、加之日曬、氧氣等條件下，花青素不穩定而開始降解；而霉菌生長分泌毒素快速增長數倍達到較高水平后不再增長。綜合看來，紫玉米種植開始第10周為最佳紫玉米采收時間，此時紫玉米中花青素含量最多且毒素含量相對較低，對后期紫玉米花青素加工中毒素控制有利。

2.4 不同干燥方式對花青素和毒素含量的影響

圖8 不同干燥方式對花青素含量的影響Fig.8 Effect of drying method on the content of anthocyanin in purple corn

如圖8所示，紫玉米三種部位相比，苞葉中花青素含量最高達到62.4mg/g。各種干燥處理中花青素均有所下降。日光干燥處理苞葉幾乎不會使花青素損失，而微波處理下苞葉花青素損失最多達到4%～13%。對于穗軸，微波干燥造成的損失依然較多達16.2%，其他3種處理在2%～4.5%之間，并不顯著。處理籽粒時，鼓風干燥產生的損失相比更少為5.9%，其他3種處理差別不大在29.4%～30.4%之間?；ㄇ嗨卦诠?、氧和熱等條件下不穩定，易分解導致花青素的損失，但與霉菌的大量生長導致分泌大量毒素相比，10%左右的花青素損失可以忽略不計，其中日光干燥更有利于花青素的保持。微波干燥用時最短，鼓風干燥與日光干燥耗時差別不大，低溫干燥耗時太長。

圖9 不同干燥方式對FB1含量的影響Fig.9 Effect of drying method on the content of fumonisin B1in purple corn

由圖9可知，干燥能不同程度的降低苞葉、穗軸、籽粒中的FB1，日光干燥、鼓風干燥、低溫真空干燥和微波干燥下，苞葉中的FB1分別減少40.7%、30.1%、16.7%和53.6%，穗軸中的FB1分別減少37.0%、39.9%、62.0%和68.4%，籽粒中的FB1分別減少39.2%、52.3%、6.6%和31.5%。相比之下，微波干燥能使FB1平均減少51.2%，日光干燥和鼓風干燥稍遜，分別為39.0%和40.8%。

表1 不同干燥方式對黃曲霉毒素含量的影響Table 1 Effect of drying method on the content of aflatoxins in purple corn

由表1可知，紫玉米中黃曲霉產生的AFG1和AFG2更多，而毒力最強的AFB1極少。毒力指數是表征各種AFs的聯合毒性的一個指標[13]。不同方式干燥后毒力指數均有大幅降低，日光干燥、鼓風干燥、低溫真空干燥和微波干燥下，紫玉米不同部位AFs的毒力指數平均分別降低62.4%、49.9%、38.4%和64.4%。日光干燥與微波干燥對AFs都有較強的解毒能力。

剛收獲的苞葉、穗軸、玉米粒中含有的水分含量高，利于串珠鐮刀菌，黃曲霉菌，寄生霉菌等真菌的

生長，產生對人體危害極大的FB1和AFs。干燥能降低紫玉米中水分，抑制霉菌的生長產毒并能降低毒素含量，可能是干燥過程中毒素發生了分解轉化，而日光和微波加熱所具有的光熱作用能加快其分解轉化作用。

3 結 論

根據實驗實際情況，通過參考AOAC，建立了測定紫玉米中AFs和FB1的高效液相色譜法，方法準確可靠，重現性好。紫玉米種植后第10周花青素質量濃度最高，所含毒素較少，是最佳采收時間。苞葉、穗軸和籽粒中，苞葉中花青素遠多于其他部位達到62.4mg/g，而且苞葉易干燥，是生產花青素的良好原料。所采用的幾種干燥方法均有解毒作用，其中微波干燥耗時短，解毒作用強，但花青素損失較多。日光干燥能較好的保持花青素，與微波干燥有相近的解毒能力，用來干燥苞葉和穗軸可以降解平均38.9%的FB1和63.5%的AFs，能耗小，是適合工業化生產的方法。鼓風干燥解毒能力稍遜，但用來干燥籽粒能大幅減少花青素的損失，是干燥籽粒的好方法。花青素作為一種保健功能成分，具有廣泛的應用市場。本研究能為紫玉米花青素生產的原料準備提供有效的指導作用。

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Effects of Maturity Degree and Drying Methods on Anthocyanin and Toxins Contents in Purple Corn

XIAO Li-xia1，WANG Fen1，YU Hong-tao1，ZHAO Xiao-yan2,*，HU Xiao-song3
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. Vegetable Research Center of Beijing Academy of Agricultural and Forest Sciences, Beijing 100097, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100087, China)

In order to explore the optimal harvesting season and drying method, the content changes of fumonisin B1 and aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in husk, cob and grain of purple corn during mature period and different drying methods were determined by high performance liquid chromatography. Results indicated that the best time for harvesting purple corn was its plantation after 10 weeks; the husk of purple corn exhibited the highest content of anthocyanin and was easy to be dried at this harvesting time point. Microwave drying had strong detoxification capability, however, it also resulted in the loss of anthocyanin. Thus, microwave drying was not suitable for industrialized production. Airflow drying was suitable for kernels. The loss of anthocyanin in husk and cob of purple corn was less during sunlight drying. In addition, sunlight drying method could degrade 50% toxins. Therefore, sunlight drying is an economic drying method and suitable for industrialized production.

purple corn；anthocyanin；fumonisin；aflatoxin；drying

S509；S513

A

1002-6630(2010)21-0142-05

2010-06-17

北京市科委成果轉化項目(Z08000503250821)

肖麗霞(1966—)，女，副教授，博士，研究方向為農產品貯藏加工。E-mail：lxxiao@yzu.edu.cn

*通信作者：趙曉燕(1968—)，女，研究員，博士，研究方向為蔬菜加工。E-mail：zhaoxiaoyan@nercv.org