熱休克蛋白 70對幼鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究

王偉 薛麗霞

心肌保護的目的是當心臟停跳，生理性冠狀動脈灌注停止后，由人工降低和(或)維持心肌細胞的代謝需要，從而最大限度地減少心肌細胞的缺血性損傷，保障心臟復跳后最大限度的心肌細胞結構完整，功能代謝等方面正常。心肌保護的方法，與心肌細胞自身的代謝狀況、結構功能特點等密切相關。嬰幼兒未成熟心肌與成熟心肌在上述幾方面都有較大的差異，因此對成熟心肌的保護方法不一定適宜于未成熟心肌。隨著先天性心臟病外科手術的發展，患者日趨低齡化使得未成熟心肌保護課題的研究日益重要，故隨著嬰幼兒心臟外科的發展，未成熟心肌保護問題亟待解決。目前誘導熱休克蛋白(HSP)多用熱休克法、感染性休克法等。藥物誘導少有報道，而該方法較其他方法更適于臨床應用。在體心肌缺血再灌注更接近活體生理。本實驗采用幼鼠在體心肌缺血再灌注模型，用川芎嗪誘導 HSP70以觀察其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及幼鼠心肌的細胞的病理改變和細胞超微結構的變化，旨在探索更適合未成熟心肌的保護方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 主要儀器:Heracus超速冷凍離心機;Thermo Forma超低溫冰箱;FHS-2型可調高速勻漿器;小型動物呼吸機;全自動生化分析儀;多功能心電監護儀;OLYMPUS顯微鏡及顯微攝像系統;JEM-1200EX透射電子顯微鏡。

1.1.2 主要材料及試劑:無水乙醇 (分析純:北京化工廠20010821);甲醛 (分析純:北京化工廠 20010821);鹽酸川芎嗪注射液[北京四制藥廠京衛準字第(80)第 422號]。

1.2 實驗動物及分組 取體重 60～75 g SD幼鼠(＜21 d)96只，雌雄不限。由本院動物中心提供。隨機分為 3組:(1)假手術(sham control，SC)組，(2)缺血再灌注 (ischem ia reperfusion，IR)組，(3)IMP預處理后缺血再灌注(TMP p reconditioning ischem ia reperfusion，TMP+IR)組。 3組于 4個時間點:TMP+IR組腹腔注射 TMP(100 mg/kg)，SC組、IR組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液后 12、24、36、48 h(每個時間點 8只)制作心肌缺血再灌注模型，SC組開胸后左前降支只穿線不結扎。

1.3 手術操作過程 20%烏拉坦(4mg/kg)腹腔麻醉，做頸部正中切口，氣管切開插管做機械正壓通氣。通氣頻率65次/min，潮氣量 5～6m l。針電極插入四肢皮下，記錄心電圖。經胸骨正中開胸，剪開心包膜暴露心臟，在冠狀動脈左前降支(LAD)起始部，用 0/4 Proleno滑線穿越左前降支下方心肌表層，在線下墊一硅膠管(結扎 LAD用)，結扎滑線阻閉左冠狀動脈，松開滑線后則再通。心肌缺血的確認依靠心電圖 ST段抬高，局部心肌變紫、紅且有節段性運動不良。各組幼鼠均于結扎 LAD 30min，再灌注 120m in(假手術組只穿線不結扎，靜置 150min)后處死。

1.4 樣本的制備 麻醉狀態下于再灌注 120min后心臟取血2ml，離心(3 000 r/min)15min，制備血清，檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。取缺血區心肌組織，4%甲醛溶液固定 24h，光鏡切片，以檢測 HSP 70含量。

1.5 血清CK-MB及LDH的檢測 于再灌注 120min后心臟取血 2ml，離心(3 000 r/min)15min，制備血清，采用全自動生化分析儀測定血清中兩種酶的含量。

1.6 免疫組化SP法檢測心肌組織HSP 70 陽性細胞的細胞漿染成棕黃色。

1.7 統計學分析 應用 SPSS 11.5統計軟件，計量資料以 ˉx±s表示，采用 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 幼鼠血清 CK-MB濃度測定結果 IR、SC組各時間亞組CK-MB的含量差異無統計學意義(P＞0.05);IR組CK-MB含量明顯高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR組 CK-MB含量明顯低于 IR組(P＜0.01)，但高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亞組的 CK-MB含量明顯低于 TMP+IR 12 h亞組(P＜0.05)，并隨時間延長有不斷升高的趨勢。見表 1。

表 1 幼鼠血清 CK-MB濃度測定結果n=32，U/L，ˉx±s

2.2 幼鼠血清LDH濃度測定結果 IP組、SC組本組各時間亞組 LDH的含量均無統計學意義(P＞0.05)，IR組LDH含量明顯高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR組 LDH含量明顯低于IR組(P＜0.01)，但高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亞組的 LDH含量明顯低于TMP+IR 12h亞組(P＜0.05)，并隨時間延長有不斷升高的趨勢。見表 2。

表 2 幼鼠血清 LDH濃度測定結果 n=32，U/L，ˉx±s

2.3 幼鼠心肌組織HSP 70光密度 OD值測定結果 SC組僅有少量的HSP 70表達，4個時間點光密度值差異無統計學意義(P＞0.05);IR組蛋白表達量高于 SC組，差異有統計學(P＜0.05)，TMP+IR組 4個時間點的光密度值明顯高于 IR組(P＜0.01)，TMP+IR 24、36、48 h亞組 的光密度值高于TMP+IR 12 h亞組(P＜0.05)，以給藥后 24 h亞組 HSP70表達量最多，光密度值隨時間的延長有不斷降低的趨勢。見表3。

表 3 幼鼠心肌組織 HSP70光密度 OD值測定結果n=32，ˉx±s

2.4 幼鼠心肌組織電鏡超微結構觀察 透射電鏡觀察幼鼠心肌缺血再灌注 120min后的心肌細胞，SC組:心肌細胞完整，肌原纖維排列整齊，Z線、M線清晰;富含線粒體且結構正常，嵴排列整齊、密集;核膜完整，染色質均勻，細密(圖 1)。IR組:肌原纖維部分溶解，Z線增寬、扭曲，其它各帶模糊，肌膜線粒體膜破損明顯，可見線粒體腫帳，嵴排列紊亂，局部或整個線粒體嵴斷裂溶解和空泡化，局部核膜破壞(圖 2)。TMP+IR組:肌纖維結構基本正常，Z線、M線清晰可見，肌纖維排列較整齊，線粒體嵴較密集，無明顯空泡形成，核膜完整(圖 3)。

圖 1 幼鼠正常心肌超微結構(×6 600)

圖2 IR組心肌超微結構(×6 600)

3 討論

本實驗采用在體幼鼠未成熟心肌缺血再灌注損傷模型，觀察藥物預處理對未成熟心肌缺血再灌注損傷的保護作用，及初步探討川芎嗪誘導 HSP 70對心肌損傷的保護機制。

目前關于心肌缺血再灌注損傷模型的制備主要有離體心臟灌注模型(即 Langendorff灌注模型)、在體心臟冠脈結扎、心肌細胞培養 3種方法，而對于未成熟心肌的研究，由于造模動物體形較小，LAD纖細，如采用在體結扎法手術難度較大，故其造模方法主要為離體心臟灌注和心肌細胞培養。但是這兩種方法由于脫離了機體內環境，斷絕了機體的神經、體液的調節及各臟器之間的協調性而不能很好的模擬活體處于心肌損傷時的狀態和環境條件。所以本實驗采用幼鼠(4～21 d)在體心臟冠狀動脈結扎法以摒棄前兩種方法的不足，從而更好地模擬嬰幼兒先天性心臟病術后心肌損傷發病情況。心肌缺血再灌注損傷程度與缺血和再灌注時間有密切關系，為了能成功制造心肌缺血再灌注損傷模型，避免實驗動物死亡率過高，故選擇缺血 30m in，再灌注 120min的時間，并作了預實驗，預實驗結果表明模型是成功的。心肌缺血再灌注損傷的主要原因之一是通過黃嘌呤氧化酶途徑產生大量氧自由基，同時體內超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等自由基清除劑酶活性降低，組織內抗氧化能力下降。大量心肌酶CK、LDH等從壞死的心肌細胞中漏出。膜對離子的轉移功能產生障礙，引發心肌細胞電活動紊亂，導致嚴重的心律失常。血清中 CK-MB(能較準確的反映心肌的損傷程度)和LDH的活性可反映心肌缺血再灌注損傷的程度;電鏡下可直觀地觀察心肌細胞結構超微變化，因此，本實驗以血清中CK-MB和 LDH活性及電鏡下的心肌細胞結構超微變化，來初步評價川芎嗪誘導HSP 70對心肌缺血再灌注損傷的影響是可行的。

由于考慮到臨床的可行性，本實驗采取川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP四甲基吡嗪)腹腔注射來誘導 HSP 70的產生，實驗結果證明是可行的:川芎嗪干預組心肌 HSP 70的含量明顯高于缺血再灌注組，且各項指標反映該組心肌的損傷情況比缺血再灌注組明顯減輕，受損心肌得到保護。川芎嗪注射液臨床上常用于抗血小板聚集，擴張小動脈改善微循環，有活血化瘀的作用，對已聚集的血小板有解聚的作用。

Currie等[1]研究認為HSP的誘導不僅增強心肌功能修復而且也增強心肌內皮功能恢復，并可延長心臟停跳時間，這進一步說明 HSP與心肌保護之間的密切關系。HSP 70轉基因鼠的心肌抗缺血再灌損傷能力顯著提高，直接證明了 HSP 70的心肌保護作用[2，3]。Amrani等[4]研究認為 HSP的誘導不僅增強心肌功能恢復而且也增強心肌內皮功能恢復，可延長心臟停跳時間，為心臟移植的供體保護提供了新方法。有研究發現心肌缺血時間小于30min是可逆性損傷階段，心肌未壞死而出現心肌頓抑，心肌頓抑能誘導 HSP的表達[5，6]。這也可能是在本實驗 IR組中受損心肌有一定量HSP 70表達的原因，但是此種心肌頓抑誘導方式還不足以對受損心肌產生足夠的保護作用。而藥物干預組的 HSP 70含量卻明顯增加，心肌的保護效果較好，推測可能還是川芎嗪為HSP 70的主要誘導因素。目前在誘導 HSP 70進行機體器官保護實驗中，大多數實驗結果證實HSP 70在誘導后 24 h達到最高峰值，對組織器官的保護效果也達到最好。Currie等[1]將SD大鼠行熱休克預處理，待其恢復 24h后進行離體 Langendorff心臟缺血 /再灌注試驗，結果發現熱休克組明顯改善缺血/再灌注損傷后心肌力學指標的恢復，減少心肌肌酸激酶釋放，減輕心肌超微結構損傷，而心肌中過氧化氫酶(catalase)活性明顯高于對照組。Karmazyn等[7]將雄性大鼠置熱環境中使其肛溫升至 42℃并維持 15min，在其恢復后不同時間檢測心肌HSP表達及心功能指標，結果表明:恢復后 24 h誘導出HSP高表達，心功能恢復明顯優于對照組，熱休克組冠狀動脈流出液中肌酸肌酶明顯低于對照組。這在本實驗中得到證實:在川芎嗪干預后24h亞組心肌 HSP 70表達量最高，心肌 CK-MB、LDH含量較其他各組下降明顯，心肌超微結構損傷減輕，在這一點上實驗結果與多數文獻報道相符。而在隨后的 36 h亞組、48h亞組HSP 70則呈逐漸下降的趨勢，心肌保護效果也逐漸下降，HSP70的這一表達特性在將來臨床手術時機的選擇上對我們有重要的提示。CK廣泛存在于細胞漿中，尤以心肌細胞為多，而 CK-MB是其較敏感反映心肌損傷的同工酶。當心肌細胞損傷時CK-MB滲出，血液中活性升高，故血清 CK-MB活性越高，證明心肌損傷亦越重，LDH亦然。本實驗以血清LDH、CK-MB活性來判斷心肌損害程度。實驗結果表明，缺血再灌注組血清 LDH、CK-MB顯著增多，與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.01)。川芎嗪干預組血清 LDH、CK-MB明顯降低(與缺血再灌注組比較P＜0.01)。

心肌保護的目的是當心臟停跳，生理性冠狀動脈灌注停止后，由人工降低和/(或)維持心肌細胞的代謝需要從而最大限度地減少心肌細胞的損傷，保障心臟復跳后最大限度的結構完整和功能代謝等方面正常[7]。心肌保護的方法，與心肌細胞自身的代謝狀況、結構、代謝功能特點等密切相關[8，9]。我們發現臨床上術前就已經處于缺氧狀態的嬰幼兒先心病患者占先心病總數的 15%～30%。缺氧未成熟心肌與正常未成熟心肌的區別在于前者在術前就已經存在缺氧損害，隨著缺氧增加，高能磷酸鹽水平下降，產生酸中毒，導致心肌收縮力下降和心功能衰退[10]。無氧代謝增加，減少了糖原水平，使心肌對缺氧耐受力更差[11]。低溫減少氧耗并不能終止氧耗，且干擾心肌能量的生成，使缺氧心肌即使是在含有較豐富代謝底物的環境中，也不能充分利用，不利于能量的再生[12]。另外，快速降溫易產生冷攣縮，產生心肌的無意義舒縮活動，反而消耗能量。在本研究中缺血再灌注組心肌受損較重，電鏡超微觀察心肌肌節斷裂，線粒體腫脹明顯，內外膜模糊不清，嵴斷裂消失。川芎嗪干預組肌原纖維排列整齊，各肌節清晰，線粒體損傷較輕，可見線粒體輕度腫脹，內外膜較清晰，未見破碎線粒體。HSP 70作為一種在進化過程中有高度保守性的應激蛋白，它在防止熱應激和其它應激引起的細胞損害或者使受損的細胞恢復方面起著重要作用。

本實驗應用川芎嗪預處理誘導心肌細胞產生HSP 70，通過檢測心肌細胞的各項指標和電鏡超微結構觀察，證實應用川芎嗪來誘導心肌細胞產生HSP70的方法是可行的。

1 Currie RW，Karmazyn M，Mailer K.Heat-shock response isassociated with enhanced postischem is ventricular recovery.Cite Res，1988，63:543.

2 Flaherty JT，Weisfeldt ML.Reperfusion injury.Free Rad Biol Med，1988，5:409-419.

3 張敏，浦鈞宗，朱全.預處理的心肌保護作用及應用前景.中國運動醫學雜志，2000，19:28-29.

4 Am raniM，Corbett J，Allen NJ，et al.Inducation of heat shockproteins enhances myocardial and endothelial funtional recovery afterprolonged cardioplegic arrest.Ann Thorac Surg，1994，57:157.

5 路海棠，趙鳳琴.降鈣素基因相關肽對大鼠心肌缺血損傷熱休克蛋白 70和核因子-kB的影響.中國全科醫學，2008，11:1941.

6 Burton RD，Mac Kenzie WE.Heart pathology associated with highsustained Gz.Aviat Space Environ Med，1975，46:1251-1253.

7 Karmazyn M，Mailer K，CurrieRW.Acquisition and decayofheat-shockenhanced postischem is ventricular recovery.Am J Physiol，1990，259:H 424.

8 汪曾煒，徐鳳翔主編.心臟外科學.第 1版.北京:人民軍醫出版社，2003.247.

9 Imura HM.Age-dependent and hypoxia-related differences in myocardial protection during pediatric open heart surger.Circulation，2001，103:1551-1156.

10 Julia PL，Buckberg GD.Studiesofmyocardialprotection in theimmature heart.I.Enhanced tolerance of immature versus adult myocardium to global ischemia with reference to metabolic differences.The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，1990，100:879-887.

11 Matthias Karck Adverse Effects of Crystalloid Cardioplegia and Slow Cooling for Protection of Immature Rat Hearts Ann Tborac Surg，1996，62:702-709.

12 Joseph A，David FT.Rapid cooling contracture with Cold cardioplegia.Ann Thorac Surg，1997，63:1353-1360.