Cosmosil Cholester-HPLC法分離番茄紅素異構體的研究

張連富, 張環偉

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫214122)

番茄紅素(Lycopene)是一種由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成的直鏈型多不飽和烯烴,分子式C40H56。由于番茄紅素分子中含有的雙鍵數目較多,分子不能內旋轉、剛性較強,所以比較容易受光、熱、氧、酸等因素的影響而產生空間異構體[1-2]。目前的研究發現,食物中(如番茄醬中)天然存在的番茄紅素以全反式結構為主(90%～98%),而人體的血清和腎上腺等組織中含有的番茄紅素主要是以順式結構為主(79%～88%)——膳食與人體組織中番茄紅素空間構型的差異性提示我們:順式結構的番茄紅素可能更有利于被人體吸收,如果對含番茄紅素食物原料進行處理并提高其中順式結構比例,就有可能提高產品的生物價并在此基礎上大幅提高其生物活性作用[3]。為了弄清上述問題,就必須獲得人體中常見番茄紅素空間異構體的單體并進行體內、體外試驗研究,而實現番茄紅素不同異構體的分離是實現上述目標的首要前提。為此,作者本文即對 HPLC分離番茄紅素異構體這種方法進行研究。

由于番茄紅素各異構體間在極性、分子大小等方面差異很小(圖1),要實現他們之間的分離比較困難。目前國內外普遍采用的分離方法是高效液相色譜法,主要有兩種方式:一種是采用C30柱來分離,但C30柱對分離不同類胡蘿卜素效果較好,對番茄紅素的順反異構體的分離效果則不是很理想[4-6];另一種是Schierle J等建立的利用3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯用的方法對番茄紅素的異構體進行分離,這種方法實現了順反異構體的分離,但對順式異構體間的分離效果也不十分理想。而且,3根色譜柱聯用在實際操作中也有很大的麻煩,需要長時間的平衡操作才能使色譜柱達到平衡狀態[7]。

鑒于目前所采用的色譜柱都存在一定的缺點,作者嘗試利用Cosmosil Cholester色譜柱來實現番茄紅素各異構體之間的分離:Cosmosil Cholester柱是Nacalai Tesque Inc.開發的反相體系的HPLC柱,采用膽甾醇鍵合硅膠填料,具有與傳統的烷基鍵合C18、C30硅膠填料一樣的疏水性,因而其對功能基的選擇能力幾乎相同;但在分子形狀特別是空間立體異構體的識別能力上Cholester柱的性能非常高。 等利用此種色譜柱對ceriporic acid異構體進行了分離,取得了較好的分離效果[8]。考慮到ceriporic acid異構體分離與番茄紅素空間異構體的分離具有一定程度的相似性(圖2),作者對Cosmosil Cholester-HPLC體系分離番茄紅素空間異構體進行了嘗試。

圖1 番茄紅素的幾種常見的順反異構體Fig.1 Structure of the all-trans/cis-isomers of lycopene

圖2 Ceriporic acid結構圖Fig.2 Structrure of Ceriporic acid isomers

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全反式番茄紅素(純度90%):華北制藥股份有限公司產品。

乙腈:AP,上海凌峰化學試劑有限公司產品;四氫呋喃:AP,上海試四赫維化工有限公司產品;乙酸乙酯:AP,國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 試驗儀器

UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計;高效液相色譜儀Ⅰ(P3000型高壓輸液泵,UV3000可變波長紫外/可見分光檢測器):北京創新通恒科技有限公司產品;高效液相色譜儀 Ⅱ(Waters 2695型HPLC,Waters 996二極管陣列檢測器;Masslynx工作站);色譜柱:Cosmosil Cholester柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。

1.3 試驗方法

1.3.1 異構化番茄紅素樣品的制備 參照Pierre Lambelet等[9]的方法進行順式化處理:稱取0.020 0 g的番茄紅素溶于100 mL乙酸乙酯中熱回流24 h。通過對反應前后的樣品進行全波長掃描,出現了文獻中報道的362 nm處的順式峰(圖3)。說明此樣品中已經含有了順式異構體,可以用于分離,摸索試驗條件。

圖3 反應前后的全波長掃描圖譜Fig.3 UV-Visible spectra of lycopene samples before and after isomerization

1.3.2 檢測方法 對反應前后的樣品進行全波長掃描,確定樣品中含有番茄紅素順式異構體;用高效液相色譜儀Ⅰ對流動相比例、進樣量、流速等試驗條件進行優化,將出峰個數、分離度R及峰形等3個指標作為分離效果的判斷標準,得出最佳分離條件;用高效液相色譜儀Ⅱ進行不同儀器間的重復性試驗。

2 試驗結果與討論

2.1 流動相的選擇

綜合考慮各種試劑的性質和對番茄紅素的溶解性性質,選取的試驗溶劑為四氫呋喃、乙酸乙酯與乙腈。選取的兩種流動相為:A)乙酸乙酯:乙腈,B)四氫呋喃(THF):乙腈。

從色譜圖中可以看出,兩種流動相在相同的配比條件下均對樣品中的物質達到了分離的目的,分離出的峰的個數也相同。對各峰的分離程度和峰形等方面來看,結果也大致相同,采用流動相A的分離度(Rmin=1.7)要稍好于用流動相B(Rmin=1.3)。但是從保留時間來看,用A為流動相的保留時間(tR=68 min)明顯長于B(tR=42 min),這樣造成了分離成本的增加,所以試驗采用四氫呋喃和乙腈作為流動相。

圖4 不同流動相條件下分離樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase

2.2 流動相比例的確定

由上步選取流動相后,選擇不同比例的流動相來進行試驗,采取V(THF)∶V(乙腈)=25∶75、10∶90、5∶95 3個比例來進行試驗,試驗結果如圖5。

圖5 不同流動相比例下分離樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase ratio

由上圖可知,隨著流動相中極性物質乙腈含量的增加,番茄紅素異構體的分離效果越好。在V(THF)∶V(乙腈)=25∶75時,只分出了3個峰。當兩者的比例達到10∶90時,可以分出5個峰,分離效果較好。但是當兩者的比例達到5∶95時,分離效果與10∶90相似,但保留時間幾乎延長了一倍。流動相比例采用10:90的比例來進行試驗。

2.3 流動相流速的確定

流動相的流速對番茄紅素異構體分離效果有一定的影響,根據本試驗所采用的儀器的性質和承載能力,采用的流量為 1.4、1.0、0.6 mL/min 3個梯度。

流動相的流速對峰的分離效果的影響并不是十分明顯(圖6)。當流量低時,分離效果稍好,但保留時間太長,減短了儀器的使用壽命。當流量增大時,泵的壓力過大,對儀器的損害也是很大的。采用了比較常用的流量1 mL/min。

2.4 進樣量的確定

研究了進樣量對番茄紅素異構體分離效果的影響,由于進樣閥的最大容積(20μL)的限制,所以采用的進樣量為20μL和10μL。

圖6 流動相不同流速分離樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase flowrate

試驗結果表明(圖7),在進樣量為20μL時,分離度和10μL進樣的結果沒有大的區別。采用高效液相色譜儀Ⅱ檢測的30μL進樣,分離度小于20 μL進樣,由于樣品量太大,柱子的載量有一定的限度,流動相在沒有將前種物質完全洗脫出來的時候,后種物質已經溶解于流動相中被洗脫出來,所以若進樣量過大,分離效果不是很好。采用的10 μL和20μL進樣對分離效果無明顯影響,則采用20μL的進樣量將有利于試驗效率的提高。

圖7 不同進樣量下分離樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of isomerized lycopene under different sample injection

2.5 重復性試驗

為了檢測試驗條件的可靠性,在以上試驗確定的試驗條件的基礎上,進行重復性試驗。圖8為高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖。同時,進行了不同儀器間的驗證性試驗,采用高效液相色譜儀Ⅱ對樣品進行重復性試驗,得到的試驗結果如圖9所示。

圖8 高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖Fig.8 Chromatogram of sample using HPLC I

圖9 高效液相色譜儀Ⅱ分離的色譜圖Fig.9 Chromatogram of sample using HPLC Ⅱ

從上面兩張色譜圖可以看出,作者所確定的試驗條件對樣品中的組分實現了分離。對分出的組分進行初步鑒定,從全波長掃描圖得出以上5個峰為同類型物質,可以認定為番茄紅素的異構體。所以,此試驗條件可以用于番茄紅素異構體的分離。與Pierre Lambelet等[9]所采用的3根正相柱聯用的方法相比,在對樣品進行了同樣的處理后進行分離,分離到了5個色譜峰,而且最小分離度也達到了1.3,基本可以將各個峰分開,并且此方法操作簡便,平衡時間短。而3根正相柱聯用的方法只分出了4個色譜峰,操作較復雜。所以本試驗基本達到預期效果。

在所確定的測定條件下,異構化處理前番茄紅素樣品(全反式)的色譜圖及其中主要組分(全反式番茄紅素,響應時間為33.95 min)的UV-Vis光譜如圖10、11所示。對比處理后的色譜圖可知,所確定的番茄紅素異構體分離條件適當,操作穩定,重現性良好。

圖10 標準番茄紅素樣品的液相色譜圖Fig.10 Chromatogram of standard all-trans lycopene sample

圖11 標準番茄紅素樣品的 UV-Vis光譜圖Fig.11 UV-Visible spectra of satandard all-trans lycopene sample

3 結 語

通過對Cosmosil Cholester柱分離番茄紅素異構體的條件進行優化試驗,得到了一種可以較好分離番茄紅素異構體的方法,并確定了分離條件為:流動相為V(四氫呋喃)∶V(乙腈)=10∶90,進樣量20μL,流量1 mL/min,檢測波長472 nm。并在此試驗條件下進行了重復性試驗,證明了此方法的重現性較好。與Schierle J等建立的3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯用法[7]相比,作者所使用的方法操作簡便,避免了由于3柱串聯所造成的漂移,易于實現色譜柱的平衡;與C30柱法[4-6]相比,本方法對各順式峰的分離效果更好些,分離效果基本達到完全分離要求。

[1]L Zechmeister,P Tuzson.Spontaneous isomerization of lycopene[J].Nature,1938,141(5):249-250.

[2]John shi,Yuzhu dai,Yukio kakuda,et al.Effect of heating and exposure to light on the stability of lycopene in tomato puree[J].Food Control,2008(19):514-520.

[3]Steven K Clinton,Curt Emenhiser,Steven J Schwartz,et al.Cis-trans lycopene isomers,carotenoids,and retinol in the human prostate[J].Cancer Epidemiology,1996(5):823-833.

[4]Curt Emenhiser,Lane C Sander,Steven J Schwartz.Capability of a polymeric C30stationary phase to resolve cis-trans carotenoid isomers in reversed-phase liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,1995(707):205-216.

[5]Jafar Muhammad EL-Qudah.Identification and quantification of major carotenoids in some vegetables[J].American Journal of Applied Sciences,2009,6(3):492-497.

[6]Volker Bonm,Ni Luh Puspitasari-Nienaber,Mario G Ferruzzi,et al.Trolox equicalent antioxidant capacity of different geometrical isomers ofα-carotene,β-carotene,lycopene,and zeaxanthin[J].Journal of Agricultural and Food Chenmistry,2002(50):221-226.

[7]Schierle J,Bretzel W,Buhler I,et al.Content and isomeric ratio of lycopene in food and human blood plasma[J].Food Chemistry,1997,59(3):459-465.

[8]Tsuzuki W,Ushida K.Preparative separation of cis-and trans-isomers of unsaturated fatty acid methyl esters contained in edible oils by RP-HPLC[J].Lipids,2009,44(4):373-379.

[9]Pierre Lambelet,Myriam Richelle,Karlheinz Bortlik,et al.Improving the stability of lycopene Z-isomers in isomerised tomato extracts[J].Food Chemistry,2009(112):156-161.