磺胺甲基唑和恩諾沙星在日本囊對蝦體內的藥代動力學研究

宋維彥,蘇永全,潘 瀅,曾凡榮,游欣欣

(1.廈門大學 海洋與環境學院,福建 廈門 361005;2.日照職業技術學院 水產學院,山東 日照 276826)

日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)是中國沿海重要的養殖品種之一,隨著養殖規模的迅速發展,加之養殖環境惡化,疾病頻繁發生。生產常常使用抗生素來中控制日本囊對蝦病害,由于缺乏相關的藥物、藥理和安全使用知識,生產中往往濫用抗生素,從而導致細菌耐藥性的產生,不僅治療效果差,而且造成環境的污染,并且直接影響到所生產對蝦的食用安全。因此,在水產養殖中如何合理、安全地用藥,是目前水產疾病防治的研究重點之一。作者利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)研究了 SMZ和ERFX在日本囊對蝦體內的藥物代謝動力學。通過研究SMZ和ERFX在日本囊對蝦體內的分布、殘留與代謝規律,為SMZ和ERFX在日本囊對蝦病害防治中的合理使用提供理論參考依據,也可做為水產養殖合理用藥的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗所用的日本囊對蝦(平均體長 8.57cm,平均體質量 7.54 g)取自福建東山縣大鏟對蝦養殖場,在室內水泥池(3 m×4 m× 0.9 m)暫養20 d,期間投喂鮮牡蠣(Crassostrea ariakensis)肉,每天換水1/3。

1.1.2 實驗藥物

注射所用藥物為 SMZ注射液(上海公誼獸藥廠生產,生產批號080309),SMZ質量濃度為100 g/L。ERFX注射液(山東興邦藥業有限公司生產,生產批號20080703),有效質量濃度為300 g/L。

1.1.3 儀器、藥品

島津 SPD-M20A高效液相色譜儀、WH-1微型漩渦混合儀、Sigmr-3N30低溫高速離心機、電熱恒溫水浴鍋、氮吹干儀、超聲波清洗器、勻漿機、精密取液器、離心管、0.2 μm過濾器、分析天平等。SMZ標準樣品(德國Dr.Enrenstorfer公司生產,批號80214),ERFX標準品(德國Dr.Enrenstorfer公司生產,批號72105),乙腈、二氯甲烷、正己烷、四丁基溴化銨均為色譜純,無水醋酸鈉、無水硫酸鈉、85%的磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、檸檬酸三鈉均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥

腹部肌肉注射給藥,注射前按設計濃度配制藥液,采用單次注射給藥,每尾蝦注射100 μL,SMZ、ERFX注射劑量分別是100,20 mg/kg。兩種藥物分別注射80尾,注射后放入培育池(1 m3)飼養。培育用水為沙濾海水,水溫21℃±0.5℃,鹽度29.91,連續充氣。

1.2.2 取樣

注射后0.25,0.5,1,2,3,4,6,12,24,36,48,72,96 h時間段取樣。每次取樣5尾對蝦。取樣部位：血淋巴、肝胰臟、腹部肌肉。血淋巴用1mL注射器取胸血竇抽取,放入2 mL凍存管保存;取樣所用注射器和存放樣品的凍存管提前用肝素鈉溶液浸泡、晾干。樣品置于-70℃冰箱保存。

1.2.3 色譜分析條件

用 VP-ODS 150L×4.6 C18 色譜柱;柱溫：室溫;進樣量：20 uL,流速：0.5 mL/min;SMZ檢測波長272 nm;流動相=水：乙腈：冰醋酸=81：18：1(v/v/v);ERFX檢測波長 278 nm;流動相=乙腈：四丁基溴化銨溶液(0.01 mol/L 磷酸調節至 pH3.1) =5：95(v/v)。

1.2.4 樣品處理

1.2.4.1 SMZ樣品處理

肝胰臟、肌肉和血淋巴SMZ樣品處理參見改進的鄭宗林[1]對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)處理方法。

1.2.4.2 ERFX樣品處理

肝胰臟、肌肉和血淋巴 ERFX樣品處理參照錢云云等[2,3]的改進方法。

1.2.5 標準曲線

取SMZ和ERFX標準樣品,分別配成100 mg/L母液,用母液配成0.05,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00 mg/L的SMZ和ERFX標準溶液系列。HPLC測定,作標準曲線,計算回歸方程和相關系數。

1.2.6 回收率的測定

采用加樣回收法,分別向空白組織加入0.1,0.5,1,5,10 mg/L,5個質量濃度梯度的SMZ和ERFX標準液1 mL,然后按樣品處理程序進行處理,HPLC測定,按標準曲線計算樣品中藥物回收量,按照下列公式計算回收率：

回收率=樣品實測濃度/樣品的理論濃度×100%。

用Excel和藥動學軟件3p97對所得數據進行處理。

2 結果

2.1 回收率的測定

對5種不同濃度的SMZ和ERFX回收率的測定結果表明,SMZ回收率范圍在82.2%～96.27%,平均回收率：肌肉為 88.92%,肝臟為 90.09%,血淋巴為84.84%;ERFX回收率范圍在84.96%～94.47%,平均回收率：肌肉為 86.04%,肝臟為 89.14%,血淋巴為91.77%。詳見表1和表2。

表1 SMZ在日本囊對蝦3種組織中的回收率Tab.1 SMZ recovery rates in the hemolymph,muscle and liver of Marsupenaeus japonicus

表2 ERFX在日本囊對蝦3種組織中的回收率Tab.2 ERFX recovery rates in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

2.2 標準曲線

分別 HPLC檢測所得的峰面積為縱坐標,相應的濃度為橫坐標做回歸方程,儀器程序自動求出標準曲線方程分別為：

在本實驗色譜條件下,兩種藥物標準液的HPLC基線走動基本平穩。

2.3 注射后 2種藥物在日本囊對蝦 3種組織內含量變化

給藥后,藥物在日本囊對蝦 3種組織內不同時間含量變化數據,用 Excel處理,得出兩種藥物在 3種組織內藥-時變化曲線如圖1、圖2所示。

圖1 SMZ在日本囊對蝦3種組織內的變化Fig.1 Changes of residual SMZ in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

圖2 ERFX在日本囊對蝦3種組織內的變化Fig.2 Changes of residual ERFX in the hemolymph,muscle and liver of Marsupenaeus japonicus

從藥-時變化曲線的變化趨勢看,注射SMZ后血淋巴的藥物質量比迅速上升,0.5 h達到183.37 μg/g的最高峰值,以后逐漸下降;肝臟的藥物質量比在2 h內迅速升高,2 h達到高峰值;藥物在肌肉內的1 h達到90.2 μg/g的最大峰值。注射ERFX后血淋巴的藥物質量比迅速上升,0.5 h達到27.01 μg/g的最高峰值,以后逐漸下降;肝臟的藥物質量比在1 h內迅速升高達到峰值。

2.4 兩種藥物在日本囊對蝦組織內的代謝動力學方程及參數

將注射給藥后所測得濃度-時間數據,使用藥物動力學軟件3p97對數據進行處理,SMZ和ERFX兩種藥物的處理結果都為經典的開放式模型。其在日本囊對蝦3種組織中的動力學方程見表3、表4,動力學參數見表5。

表3 SMZ在日本囊對蝦3種組織內的代謝動力學方程Tab.3 Pharmacokinetic equations for SMZ in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

表5 SMZ在日本囊對蝦3種組織內的代謝動力學參數Tab.5 Pharmacokinetic parameters of SMZ and ERFX in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

3 討論

本實驗采用肌肉注射方式,探討SMZ和 ERFX在日本囊對蝦體內的藥物代謝動力學,給藥后觀察實驗動物,只在藥物注射后3 h內死亡1只,其他時間無死亡;在18,36 h分別有2只,48 h有1只正常脫皮,說明注射法給藥對日本囊對蝦的生長沒有明顯的負面影響,且注射法給藥比投喂法和藥浴法給藥的藥物劑量準確,藥物進入體內的時間基本一致。

3.1 SMZ和ERFX在日本囊對蝦的動力學特征比較

研究結果表明,單次肌肉注射方式給藥后,SMZ在肌肉和血淋巴中的動力學方程藥物時量曲線關系符合開放一室模型;SMZ在肝臟的動力學方程為開放的兩室模型。實驗中不同組織的代謝適合不同的房室模型,這與中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[4]和羅氏沼蝦[1]各組織都為二室模型,花鱸(Lateolabrax japonicus)[5]各組織都是一室模型不盡相同。

從SMZ吸收半衰期看出,SMZ日本囊對蝦組織內吸收速度比較快,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴吸收半衰期分別是0.495 2,0.097 1,0.017 0 h;藥物吸收后在 3種組織內不是平均分布,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴達到的最高血藥質量比最高峰分別為 96.771 6,89.831 7,75.106 1 μg/g;從濃度-時間曲線下面積AUC看,肝臟最大為1264.788 3(μg/g)/h,肌肉中最小為645.238 8(μg/g)/h,血淋巴中為1 008.185 0 (μg/g)/h;SMZ在日本囊對蝦3組織內消除速度也不相同,肝臟、肌肉和血淋巴的消除半衰期分別為19.128 4,4.579 9,9.185 5 h,肌肉的消除半衰期最短,肝臟的消除半衰期最長。與其他動物相比,SMZ在草魚[6]體內單方與復方口灌給藥其消除相半衰期分別為(13.31±0.61和12.64±0.55 h);羅氏沼蝦[1]肌注 SMZ,其在血淋巴中消除半衰期為 24.92 h;19℃條件下單次肌注,SMZ在中國明對蝦血淋巴內的消除半衰期為 10.87 h[4]。在血淋巴中的消除半衰期和中國明對蝦相似,比羅氏沼蝦短。

ERFX肌肉注射方式給藥后,血淋巴和肝臟中的藥物動力學方程時量曲線關系符合開放的一室模型;肌肉中為開放的二室模型。和 ERFX在羅氏沼蝦[2]的肌肉組織為二室模型相同,ERFX在鯉魚(Cyprinus carpio)[7]鯽魚(Carassius auratus)[8]血液中的代謝為一室模型,和日本囊對蝦血淋巴的代謝模型一致。

從吸收半衰期可以看出 ERFX在日本囊對蝦組織內吸收速度非常快,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴吸收半衰期分別是0.095 2,0.215 1,0.123 h,藥物吸收后在各組織內不是平均分布的,不同組織達到的最高藥物質量濃度不同,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴達到的最高血藥質量比最高值分別為 48.653,52.713 1,39.763 9 μg/g;從濃度-時間曲線下方的面積AUC來看,肌肉最大為756.024 6(μg/g)/h,肝臟最小為 363.478 0(μg/g)/h,血淋巴為 599.713 9(μg/g)/h;ERFX在日本囊對蝦的各組織內消除速度并相同,其在肝臟、肌肉和血淋巴的消除半衰期分別為 4.760 3,24.805 4,10.370 8 h,肌肉的消除半衰期最長,肝臟的消除半衰期最短。與其他生物相比,如吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)的肝臟、肌肉、血漿對ERFX的消除半衰期分別為15.16,16.83,17.19 h,中國對蝦的肌肉對ERFX的消除半衰期為27.9 h[9],歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)肝臟、肌肉、血漿消除半衰期分別為59.32,901.24,908.07 h[10],日本囊對蝦在肝臟、肌肉和血淋巴中消除半衰期比羅非魚長。但比歐洲鰻鱺的短,在肌肉中的消除半衰期比中國對蝦短。

3.2 SMZ和ERFX在日本囊對蝦的代謝特征

注射SMZ后在日本囊對蝦3種組織內吸收速度有較大差異,在血淋巴內被迅速吸收,0.5 h即達到183.37 μg/g的最大值,但比中國明對蝦血淋巴在0.083 h血藥質量比即達到峰值時間長[4];在肌肉組織的達到峰值的時間是1 h,質量比為90.2 μg/g;肝臟中藥物達峰時間是2 h,質量比為154.92 μg/g。

注射ERFX后日本囊對蝦體3種組織對藥物吸收速度有較大差異,在血淋巴內被迅速吸收,0.5 h即達到 27.01 μg/g的最大值;藥物在肌肉和肝臟達到峰值的時間都是 1 h,質量比分別為 9.26和 49.76μg/g;從圖1、圖2中變化曲線可以看出注射藥物后,在 3種組織內很快達到峰值,之后藥物在組織內的含量開始下降,從出現峰值到48 h藥物含量下降幅度較大,48 h后下降幅度緩慢。到96 h各組織中的含量都大于0.1 μg/g。這兩種藥物注射后都能很快被吸收,在血淋巴中達到最大濃度的時間相似,但在血淋巴吸收利用卻有差別,血淋巴對SMZ吸收利用是注射濃度的 1.833倍比 ERFX的 1.351倍高;注射ERFX后肝臟中出現峰值時間要比注射SMZ早1 h。

3.3 SMZ和ERFX在日本囊對蝦中的應用

為了獲得較理想的防治效果,水產用藥常采用多次給藥以維持一定的血藥水平,多劑量給藥一般是固定用藥的劑量和間隔時間。日本囊對蝦肌肉、血淋巴和肝臟是主要的發病部位,如肌肉白濁病、肝胰臟白濁病、紅腿病等。根據SMZ和ERFX藥物動力學參數和代謝特點,發病組織是血淋巴時,選用

SMZ防治能在發病部位獲較高的藥物濃度,肝組織發病選用 ERFX防治能在發病部位獲較高的藥物濃度。根據SMZ和ERFX在血淋巴中消除半衰期分別為9.19和10.37 h,在日本囊對蝦的血淋巴中屬于慢速消除類藥物[11],若血淋巴發病用這兩種藥物治療,則建議每天用藥2～3次,最好1次／8 h或1次／12 h,使藥血濃度在用藥期間維持在較高的水平;SMZ在肌肉中和ERFX肝臟中消除半衰期分別為4.58 d和4.76 d,屬于中速[12]消除藥物,若肌肉中發病需要用SMZ或肝臟中發病需要用 ERFX進行治療,建議采用3～4次／d的給藥方案,最好1次／6 h或1次／8 h;但是對蝦發病時,常表現癥狀和發病部位不全一致的,或出現多部位發病,這時應考慮綜合因子,用這兩種藥物防治時,建議每天給藥3次,連用2 d。經 5～6個劑量后,藥物在體內的累積量約達 95%左右,基本達到了穩定狀態[11]。若再繼續多次用藥,其藥血濃度則可能遠超過第一次用藥的濃度,可能會發生副作用。

根據中華人民共和國農業行業標準(NY5070-2002),SMZ在水產品中的最高殘留限量為0.1μg/mL。農業部783號公告-2-2006中規定ERFX殘留量小于0.1 μg/g。比較SMZ和ERFX在日本囊對蝦肝臟、肌肉和血淋巴等組織的濃度變化,SMZ在血淋巴中的濃度相比較大而 ERFX在肝臟中較大,但變化趨勢相近,都是經吸收達峰值后逐漸變小,在48 h內降解較快,但是在96 h內兩種藥在各個組織內的含量都大于 0.1 g/g。雖然肌肉是對蝦可食性組織,但是在食用對蝦時不能把肝臟和血淋巴有效地分開,常常都是同時食用。因此判定休藥期要按照各組織中半衰期最長的組織含量的消除來定,結合SMZ和ERFX在肌肉中的消除規律,在21℃±0.5℃的條件下。建議SMZ在日本囊對蝦的休藥期不少于10 d,ERFX在日本囊對蝦的休藥期不少于12 d。

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