非酒精性脂肪性肝病患者肝組織脂聯素表達及其意義

趙彩彥 孔令波 李亞 王亞東 周俊英 甄真

非酒精性脂肪性肝病患者肝組織脂聯素表達及其意義

趙彩彥 孔令波 李亞 王亞東 周俊英 甄真

目的 探討肝組織脂聯素表達在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發病機制中的作用及地位,為 NAFLD的預防及治療提供新的思路。方法 47例 NAFLD患者及 20例正常對照均測量身高、體重,計算體重指數(BMI);分別應用ELISA方法測定血清脂聯素(adiponectin)濃度、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度;采用穩態模式評估法,計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR);對肝組織進行 HE、Masson染色及脂聯素免疫組化染色,對脂聯素表達量進行半定量分析。結果 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)組肝組織脂聯素表達較對照組及單純性脂肪肝組顯著減少(P＜0.05),與血清脂聯素濃度呈顯著正相關(P＜0.01),與血清 TNF-α濃度、ALT、HOMA-IR及肝組織炎癥、纖維化程度呈負相關(P＜0.01),而與脂變程度不相關(P＞0.05)。多元線性逐步回歸分析顯示,肝組織脂聯素表達是肝組織炎癥及纖維化發生的保護因素。結論

肝組織脂聯素表達在NAFLD患者肝組織炎癥及纖維化發生發展中起保護性作用。

脂聯素;脂肪肝,非酒精性;肝組織

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現。脂聯素是一種近年新發現的脂肪細胞因子,有胰島素增敏、抗炎等作用[1]。本實驗應用免疫組化染色方法,研究脂聯素在 NAFLD患者肝組織的表達情況及其與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及肝組織病理改變的關系,揭示肝組織表達的脂聯素在NAFLD發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年 7月至 2007年 6月于我院就診的NAFLD患者 47例,男 26例,女 21例;平均年齡(44±14)歲,符合中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組 2006年2月修訂的 NAFLD臨床診斷標準[2],其中 16例行肝組織活檢經病理證實。根據有無 ALT升高或肝組織病理結果,分為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)組及單純性脂肪肝組。對照組 20例,男 10例,女 10例;平均年齡(41±13)歲;其中健康獻血員 15例,行肝血管瘤切除術者 5例。3組年齡、性別比等差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 材料 脂聯素單克隆抗體,購自英國abcam公司;脂聯素及 TNF-α酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于美國 RB公司。

1.3 體重指數(bodymass index,BMI)及生化指標測定 所有研究對象均測量身高及體重,計算 BMI=體重(kg)/身高(m)2;ALT、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)用日本Olympus AU 2700全自動生化分析儀檢測;空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平用放射免疫法測定。采用穩態模式評估法(homeostasismodel assessment,HOMA)計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR),HOMA-IR=FINS×FBG/22.5,取自然對數后成為正態分布。

1.4 血清脂聯素及 TNF-α濃度 ELISA方法測定。

1.5 病理檢查 將肝活檢組織及肝血管瘤切除術中所取正常肝組織進行石蠟包埋,制成 5μm厚連續切片。HE染色觀察普通病理,每張切片隨機選擇 10個視野,20倍物鏡下計算平均脂變肝細胞百分比;炎癥活動度根據美國NASH臨床研究協會2005年制定的NAFLD組織學評分系統[3]進行評分,積分標準分為小葉內炎癥(L,0～3)、肝細胞氣球樣變性(B,0～2)、匯管區炎癥(P,0～1),由富有經驗的病理科醫生在不知分組的情況下作出評分,將各種病理變化評分相加得到總積分,記分公式為 L+B+P。Masson染色觀察纖維化程度。

1.6 免疫組化染色 采用 Power Vision TM二步法：將石蠟包埋的肝組織制成 5μm厚連續切片;常規脫蠟至水;高壓修復抗原;3%H2O2溶液室溫孵育 10m in;胃蛋白酶消化,37℃孵育30min;滴加鼠抗人脂聯素單克隆抗體,4℃過夜;滴加山羊抗小鼠 IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育 30min;滴加 DAB顯色劑,顯色 2min,自來水終止顯色;蘇木精復染,中性樹膠封片。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。棕黃色著色為陽性表達。

1.7 病理圖像分析 肝組織脂聯素表達量及膠原纖維含量采用多功能病理圖像分析儀(北京航空航天大學圖像中心研制)進行分析。20倍物鏡下計算平均面密度(陽性面積與統計場面積百分比),以平均面密度作為半定量分析指標。

1.8 統計學分析 應用 SPSS 13.0統計軟件,計量資料以±s表示,比較用單因素方差分析或用Kruskal-Wallis H檢驗,LSD-t法或 Nemenyi法進行組間比較,相關分析用直線相關及多元線性逐步回歸,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMI、生化指標及血清脂聯素濃度 單純性脂肪肝組及NASH組BMI及 HOMA-IR顯著高于對照組(P＜0.01),單純性脂肪肝組與 NASH組之間差異無統計學意義(P＞0.05);NASH組ALT、TNF-α顯著高于單純性脂肪肝組及對照組 (P＜0.01),單純性脂肪肝組與對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05);血清脂聯素濃度在 3組各不相同,從高到低依次為對照組、單純性脂肪肝組、NASH組(P＜0.01)。見表 1。

2.2 肝組織病理學變化 16例行肝組織活檢的患者中,單純性脂肪肝與 NASH各占 8例。單純性脂肪肝組患者肝細胞存在不同程度脂肪變性;NASH組患者肝組織存在肝細胞脂肪變性,小葉內有炎性細胞浸潤、點狀或灶性壞死,有竇周纖維化,匯管區可見炎性細胞浸潤,向小葉內延伸,偶見P-V橋接壞死。

2.3 肝組織脂聯素表達 肝組織免疫組化染色可見脂聯素主要表達于肝竇內皮細胞及匯管區血管內皮細胞,在炎性壞死區域也有表達(圖1),單純性脂肪肝組及對照組肝組織脂聯素表達量顯著高于 NASH組(P＜0.01),單純性脂肪肝組與對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 2。

圖1 肝組織脂聯素表達(免疫組化 ×200)

2.4 相關性分析

2.4.1 血清脂聯素濃度的相關分析：所有 NAFLD患者血清脂聯素濃度與 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α濃度呈顯著負相關(r分別為 -0.623、 -0.614、-0.809、 -0.664,P＜0.01)。

2.4.2 肝組織脂聯素表達的相關分析：在行病理檢查的NAFLD患者中,肝組織脂聯素表達量與血清脂聯素濃度呈顯著正相關,(r=0.821,P＜0.01);與 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α濃度、肝組織炎癥活動度及膠原纖維含量呈負相關,(r分別為 -0.550、 -0.529、-0.805、 -0.739、 -0.783、 -0.798,P＜0.01);與肝脂變程度不相關(P＞0.05)。

2.5 多元線性逐步回歸 對行病理檢查的NAFLD患者,采用多元逐步回歸法,以肝組織炎癥(Y)為應變量,以肝組織脂聯素表達量(X1)、血清脂聯素濃度(X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清 TNF-α濃度(X5)為自變量建立回歸方程,在0.05水準,肝組織脂聯素表達量及血清TNF-α濃度進入方程,Y=-3.401-57.473×1+2.83×5,R2=0.756。說明 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯素在肝組織炎癥的發生中起保護性作用。以肝組織膠原纖維含量(Y)為應變量,以肝組織脂聯素表達量(X1)、血清脂聯素濃度 (X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清TNF-α濃度(X5)為自變量建立回歸方程,在 0.05水準,肝組織脂聯素表達量及血清 TNF-α濃度進入方程,Y=-0.031-0.507×1+0.035×5,R2=0.836。說明 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯素在肝組織纖維化的發生中起保護性作用。

表1 3組 BMI、生化指標及血清脂聯素濃度比較±s

表1 3組 BMI、生化指標及血清脂聯素濃度比較±s

注：與對照組比較,＊P＜0.01;與單純性脂肪肝組比較,#P＜0.01

組別 BM I(kg/m 2) HOMA-IR(對數值) ALT(U/L) TNF-α(pg/m l) 脂聯素濃度(μg/m l)對照組(n=20) 20.3±2.1 1.18±0.20 19±3 2.02±0.16 3.81±0.4單純性脂肪肝組(n=28) 27.9±2.9＊ 2.18±0.28＊ 21±8 2.16±0.16 2.8±0.6＊NASH組(n=19) 28.3±1.9＊ 2.19±0.33＊ 75±14 2.66±0.38＊# 1.3±0.3＊#F/H值 72.971 96.367 40.542 32.316 159.246 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 3組肝組織脂聯素表達量及肝組織病理改變比較±s

表2 3組肝組織脂聯素表達量及肝組織病理改變比較±s

注：與對照組比較,＊P＜0.01;與單純性脂肪肝組比較,#P＜0.01

組別 脂聯素表達量(%) 肝脂變(%) 炎癥活動度(分) 膠原纖維量(%)對照組(n=5) 4.2±0.8 1.2±1.0 0 2.00±0.21單純性脂肪肝組(n=8) 3.3±0.3 42.5±19.5＊ 0 2.23±0.25 NASH組(n=8) 1.8±0.6＊# 42.9±18.8＊ 3.63±1.06 5.87±1.19＊#F/H值 32.525 10.945 17.667 15.731 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

脂聯素在 NAFLD的發生發展中起著保護性作用。盡管有研究報道,脂聯素通過減少脂質合成,增加脂肪酸氧化,減少肝臟脂質含量[3]。但是,在本研究中,肝組織脂聯素表達量在單純性脂肪肝組與對照組之間無差異,在NASH組卻顯著降低,并且與肝組織炎癥及纖維化程度密切相關,與肝脂變程度不相關,提示,肝組織表達的脂聯素在肝臟主要發揮其抗炎、抗纖維化作用。

本研究發現,血清脂聯素濃度及肝組織脂聯素表達量均與炎癥因子 TNF-α水平呈負相關,肝組織脂聯素表達量與肝組織炎癥程度呈負相關,多元逐步回歸分析提示 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯素在肝組織炎癥的發生中起保護性作用。脂聯素刺激抗炎因子的釋放、抑制炎性因子的產生是其抗炎作用的主要體現。脂聯素可以抑制脂肪組織C-反應蛋白及TNF-α產生;通過環磷腺苷/蛋白激酶 A依賴的信號途徑抑制內皮細胞 IL-8、血管細胞粘附分子-1及反應性氧簇產生;通過刺激環氧合酶-2/前列腺素 E2途徑抑制心肌細胞 TNF-α產生;通過抑制 Toll樣受體介導的 NF-κB活化減少巨噬細胞 TNF-α及 IL-6產生,通過增加IL-10產生增加金屬蛋白酶組織抑制劑-1產生[5]。在肝臟,脂聯素可能通過這些途徑發揮其抗炎作用。脂聯素表達減少使其在肝臟的抗炎作用減弱,導致炎癥的發生發展。另外,脂聯素與 TNF-α可以抑制對方的表達,并抑制對方在靶器官的作用[6],在肝組織發生炎癥后,表達增加的 TNF-α可能抑制了脂聯素在肝臟的表達及其抗炎作用,使脂聯素抑制TNF-α的作用減弱,因此形成惡性循環,使炎癥進一步發展。

在本研究中,肝組織脂聯素表達量與肝組織膠原纖維含量呈負相關,多元逐步回歸分析提示 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯素在肝組織纖維化的發生中起保護性作用。轉化生長因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)及肝星狀 細胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纖維化發生中起著關鍵作用。有研究發現,與相同處理條件下野生型小鼠相比,脂聯素基因敲除小鼠在經四氯化碳刺激 12周后,血漿 TGF-β1、結締組織生長因子水平明顯升高,肝臟發生廣泛的纖維化,證實脂聯素可以通過抑制 TGF-β1、結締組織生長因子表達阻止肝纖維化的發生[7]。另外,在小鼠HSC培養過程中發現,靜止狀態HSC可以表達脂聯素 mRNA及脂聯素蛋白,脂聯素通過減少 α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)和增殖細胞核抗原表達抑制活化HSC的增殖與遷移,并促進其凋亡,抑制肝纖維化的發生發展[8]。另外,TNF-α除了參與炎性反應外,還可以通過激活HSC等途徑參與肝纖維化的發生,所以,脂聯素的抗纖維化作用還與其對TNF-α抑制作用相關。

本研究顯示,脂聯素主要表達于肝竇內皮細胞、匯管區血管內皮細胞,炎癥區域也有表達,肝細胞沒有表達。現在已經發現了Ⅰ、Ⅱ兩型 G蛋白偶聯脂聯素受體,其中Ⅱ型主要表達于肝細胞膜[9],脂聯素在上述細胞及區域表達后,通過旁分泌途徑作用于肝細胞膜上受體。脂聯素與其受體結合后通過活化一磷酸腺苷活化的蛋白激酶以及激活 p38絲裂原激活的蛋白激酶兩個途徑,引起下游一系列分子活性的改變,發揮其生物學作用[10]。在本研究中,NASH組患者肝組織脂聯素表達較單純性脂肪肝組及對照組減少,單純性脂肪肝組與對照組之間無差異,而血清脂聯素濃度在 NASH組低于單純性脂肪肝組及對照組,單純性脂肪肝組低于對照組。在NAFLD發生時,脂聯素在其他組織的表達量也發生改變,并影響血清脂聯素濃度。有研究證實,在 NAFLD患者,脂肪組織脂聯素 mRNA表達量減少[11]。

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2 中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南.中華肝臟病雜志,2006,14：161-163.

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Exp ression and significance of adiponectin in liver of patientswith nonalcoholic fatty liver disease

ZHAO Caiyan＊,KONG Lingbo＊,LIYa,eta l.＊Department of In fectious Disease,The Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China

Objective To investigate the changes of expression of adiponectin in the liver and their significance in patients with nonalcoholic fatty liverdisease(NAFLD).M ethods 47 patientswith NAFLD and 20 healthy subjects were chosen in our study.Serum adiponectin and tumor necrosis factor-α(TNF-α)were quantified by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The levels of body mass index(BMI),alanine aminotransferase(ALT),fasting blood glucose and fasting insulin were also assayed.Insulin resistance(IR)was estimated by using the homeostasis model assessment(HOMA).The histological manifestation of liver was analyzed by HE and Masson staining.The expression of adiponectin in the liver was detected by immuno histochemical staining,and the relative quantity ofadiponectin was assessed by sem iquantitative analysis.Resu lts

The relative quantity ofadiponectin in liver of NASH patients was remarkably lower than that in simple steatotic liver and normal liver.The expression ofadiponectin in the liver was positively correlated with the levels of serum adiponectin,and negatively correlated with the levels of serum TNF-α,ALT,HOMA-IR and the degreeof hepatic inflammation and fibrosis.The mu ltivariant linear gradual regressive analysis showed that the exp ression of adiponectin in the liver was a p rotective factor of hepatic inflammation and fibrosis.Conclusion The exp ression of adiponectin in the liver acts as a protective factor in the developmentof inflammation and fibrosis in NAFLD.

adiponectin;fatty liver;nonalcoholic

R 575

A

1002-7386(2010)05-0522-04

050051 石家莊市,河北醫科大學第三醫院感染科(趙彩彥、孔令波、王亞東、周俊英、甄真),中心實驗室(李亞)

2009-11-13)