短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑動脈溶栓的實驗研究

王寧軍 楊維竹 江娜 鄭曲彬 黃兢姚 黃寧 申權

短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑動脈溶栓的實驗研究

王寧軍 楊維竹 江娜 鄭曲彬 黃兢姚 黃寧 申權

目的觀察短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑不同劑量溶栓的量效關系；對短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑、瑞替普酶、尿激酶溶栓結果進行比較，評價短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑溶栓效果。方法在36只成年畢格犬建立急性腦栓塞模型，隨機分為生理鹽水組、瑞替普酶組、尿激酶組、短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑大劑量組(75μg/kg)、中劑量組(37.5μg/kg)及小劑量組(18.75μg/kg)6組，分別予以相應干預處理。溶栓后分別于60、120、180、240分鐘行頸內動脈造影觀察栓塞動脈再通情況并抽取靜脈血液測定TT、PT、APTT、FIB及DD。結果（1）溶栓后2小時GBV-PA大劑量組(75μg/kg)、中劑量組(37.5μg/kg)、小劑量組(18.75μg/kg)及生理鹽水組血管再通率分別為86.7%、52.4%、33.3%和0.00%，大劑量組血管再通率明顯高于中、小劑量組。（2）溶栓后2小時瑞替普酶組、GBV-PA大劑量組、尿激酶組的血管再通率分別為88.9%、86.7%和57.9%，瑞替普酶組、GBV-PA大劑量組均高于尿激酶組，GBV-PA大劑量組和瑞替普酶組兩者之間無統計學差異。結論短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑動脈溶栓效果呈劑量依賴性；大劑量短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑比尿激酶具有更強的血栓溶解作用，與瑞替普酶溶栓效果相當。

短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑；瑞替普酶；尿激酶；溶栓；動脈

缺血性腦卒中是嚴重威脅人類健康的一種疾病，占所有腦血管病患者的60%～80%。溶栓治療是急性缺血性腦卒中的首選治療方法。因溶栓藥物的選擇關系到治療的成敗，故溶栓劑的研究與開發成為近年溶栓研究的熱點；其中，開發新型天然溶栓藥物是溶栓藥物研究的重要方向。在眾多的天然溶栓藥物中，蛇毒由于含有多種生物活性蛋白質和多肽[1]而備受關注。本實驗研究所采用的短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑（plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom，GBV-PA）即是從短尾蝮蛇毒中提取的一種新型的溶栓藥物。本實驗研究通過比較不同劑量短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑溶栓效果，觀察其量效關系；通過對短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑與瑞替普酶、尿激酶動脈溶栓結果進行比較，評估短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑溶栓效果。

1 材料和方法

1.1 犬腦栓塞模型的制作：

1.1.1 自體血栓的制備

抽取畢格犬自體靜脈血5ml，常溫下4000轉/分離心10分鐘后取上層血漿1ml加入凝血酶100u混勻并注入尖端縮細的玻璃試管中（縮細部分內徑1.5mm），凝固后取出置入生理鹽水中反復漂洗，剪成長為5～8mm的血栓條備用。

1.1.2 腦栓塞模型的建立

將犬用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，仰臥固定后逐層分離、暴露右側股動脈和左側股靜脈，用改良Seldinger法分別穿刺右股動脈及左股靜脈置入4F導管鞘，左股靜脈導管鞘用于抽血、補液等用途。經右股動脈鞘先引入4F多功能導管至頸總動脈與頸內動脈分叉處近端，再利用同軸導管技術將3F微導管頭端置于頸內動脈起始部上方2～3cm處，行頸內動脈正、側位造影清楚顯示大腦前、中動脈走行情況。用2ml注射器吸入3～5條血栓條經微導管注入頸內動脈，在注入血栓條過程中多次造影證實大腦中動脈栓塞后撤出導管。造影見到以下二種情況之一可認為栓塞成功：1）與栓塞前相比，某支血管走行中斷；2）雖未見到明顯血管中斷，但正位或側位毛細血管期見到明顯的毛細血管網局部缺失。模型建立后，按下述分組進行實驗。

1.2 溶栓方法

1.2.1 動物分組及溶栓時間

本實驗共選用健康畢格犬36只(雌、雄不限)，體重10～15kg，按上述方法制作腦栓塞模型，并隨機分為A、B、C、D、E、F6組：A組為陰性對照組，以0.9%生理鹽水行頸內動脈灌注；B組以瑞替普酶行頸內動脈灌注溶栓；C組以尿激酶行頸內動脈灌注溶栓；D、E、F組分別以不同劑量的GBV-PA行頸內動脈灌注溶栓。溶栓后60、120、180、240分鐘分別行頸內動脈造影，觀察栓塞動脈再通情況。實驗結束后以PROLENE線行動、靜脈穿刺口吻合。

1.2.2 溶栓劑劑量

本實驗分別選用生理鹽水（NS）、瑞替普酶（r-PA）、尿激酶(UK)、短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑（GBV-PA）作為溶栓劑：NS劑量為10ml，r-PA溶栓劑量為0.3mg/kg，UK溶栓劑量為6000U/kg，GBV-PA溶栓劑量分別為75μg/kg、37.5μg/kg、18.75μg/kg。所有溶栓劑均溶于50ml生理鹽水中，以微注泵泵入，注射速率為0.04ml/s。

1.3 觀察指標

1.3.1 DSA腦血管造影

溶栓后行腦血管造影，觀察栓塞動脈再通情況，以溶栓后2小時栓塞動脈再通率作為對比指標。血管再通標準：1）完全再通，顱內血管分支顯示清楚；2）部分再通，主干和/或部分二、三級分支動脈中斷和/或狹窄；3）不通，阻斷以下二、三級分支不顯影。其中1、2造影表現為再通。

1.3.2 凝血功能

栓塞前，栓塞后即刻、60、120、240分鐘抽取靜脈血檢測凝血酶時間(thrombin time，TT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time ，APTT)、纖維蛋白原（fibri-nogen，FIB）、D-二聚體(D-dimer，DD)等值。

1.4 統計學分析

使用SPSS12.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（），再通率的比較采用Fisher精確概率法，凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原（FIB）、D-二聚體(DD)等指標比較采用t檢驗，檢驗水平a＝0.05，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同劑量GBV-PA頸內動脈溶栓效果比較

本組觀察不同劑量GBV-PA溶栓效果，研究GBV-PA溶栓量效關系。溶栓后120分鐘造影，生理鹽水組栓塞動脈無再通，GBV-PA各組栓塞動脈均有不同程度的再通（圖1、圖2、圖3）。溶栓后120分鐘GBV-PA大、中、小劑量組栓塞動脈的再通率分別為86.7%、52.4%和33.3%（表1），各溶栓組與生理鹽水對照組之間再通率均有統計學差異（P＜0.05）；GBVP A大、中、小劑量各組之間的再通率比較亦有統計學差異（P＜0.05），大劑量組血管再通率明顯高于中、小劑量組。

對凝血功能的影響：大劑量G B V-P A可使T T、P T、APTT延長，與陰性對照組有統計學差異；中、小劑量GBVPA僅使TT、PT、APTT輕度延長，但與陰性對照組無統計學差異；各組GBV-PA使血液中纖維蛋白原(FIB)含量輕度降低，但與陰性對照組無統計學差異。

本組溶栓結果表明在一定范圍內，GBV-PA動脈溶栓效果呈劑量依賴性，即溶栓劑量越大，溶栓效果越好。

2.2 GBV-PA大劑量組、瑞替普酶組、尿激酶組頸內動脈溶栓效果比較

表1 GBV-PA不同劑量組溶栓2h后血管再通情況

表2 不同溶栓劑溶栓2h后血管再通情況

圖1 為栓塞前頸內動脈造影像

圖2 栓塞后造影見大腦中動脈截斷（箭頭），遠端分支消失。

圖3 大劑量GBV-PA動脈溶栓后2h造影 見栓塞之大腦中動脈再通（箭頭）。

圖4 為栓塞前頸內動脈造影像

圖5 栓塞后造影 見大腦中動脈分支之一截斷（細箭），遠端消失；另一分支近端狹窄（粗箭），遠端消失。

圖6 瑞替普酶溶栓后2小時造影 見大腦中動脈截斷分支（箭頭）及狹窄分支均完全再通。

本組比較研究大劑量GBV-PA、瑞替普酶、尿激酶動脈溶栓效果。溶栓后120分鐘造影，陰性對照組栓塞動脈無再通，各溶栓劑組栓塞動脈均有不同程度的再通（圖4、圖5、圖6）。溶栓后120分鐘瑞替普酶組、GBV-PA大劑量組、尿激酶組各組的血管再通率分別為88.9%、86.7%和57.93%（表2），各溶栓劑組與陰性對照組再通率均有顯著差異。瑞替普酶組與GBV-PA大劑量組再通率均高于尿激酶組并有顯著差異。再通率GBV-PA大劑量組與瑞替普酶組之間無顯著差異（P＞0.05）。

對凝血功能的影響：各組溶栓劑均可使TT、PT、APTT延長，各組之間比較無顯著差異（P＞0.05）；尿激酶使血液中纖維蛋白原(FIB)含量明顯降低，與陰性對照組有顯著差異（P＜0.05）。

本組溶栓比較結果顯示大劑量GBV-PA動脈內溶栓效果與瑞替普酶相當，明顯優于尿激酶，但副作用小于尿激酶。

3 討論

溶栓劑的選擇是溶栓治療成敗的關鍵因素。目前常使用的溶栓劑有幾個明顯的不足：再栓塞、出血副作用和價格昂貴。尿激酶作為目前溶栓最常用的藥物[2]，其主要副作用為易引起出血。本組實驗中尿激酶組溶栓后凝血功能檢測顯示尿激酶對凝血系統的影響較明顯，除延長凝血酶時間、部分凝血活酶時間外，還顯著降低血液中的纖維蛋白原含量。瑞替普酶是第三代溶栓藥物的代表，是目前公認的溶栓效果最好的藥物。瑞替普酶在溶栓時具有纖維蛋白特異性：即當有纖維蛋白存在時，瑞替普酶與纖溶酶原的親和力增加600倍左右[3]，故瑞替普酶溶栓效果明顯優于尿激酶。但同時有研究表明使用本品成功溶栓后不久，還會發生再栓塞。在對人體的溶栓研究中也存在著類似的問題。本實驗結果證明了瑞替普酶具有很強的溶栓作用，但因瑞替普酶價格昂貴[4]，不適合我國國情，現階段尚難以大規模普及。

由于現有的溶栓劑具有上述不足，因此研制高效低價的溶栓藥物仍是一個十分重要的課題[5]。蛇毒制劑由于具有抗凝、溶栓和改善微循環等多種效應，成為國內外溶栓藥物研究的重要方向之一。

1993年中科院昆明動物研究所的張云[6]等首先報道了從竹葉青蛇毒中分離、純化出具有激活纖溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA)，為新型溶栓藥物的開發提供了新的思路。此后福建醫科大學蛇毒研究所亦從短尾蝮蛇毒中分離純化出蛇毒纖溶酶原激活劑[7]，研究提示其亦具有溶栓作用。短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑（GBV-PA）屬于絲氨酸蛋白酶家族，是一種單鏈糖蛋白，分子量為40Kda，等電點(isoelectric point，PI)為PH5.2[6]。GBV-PA分子中含有六對二硫鍵，并由His41、Asp86和Ser180組成催化活性中心，通過專一性地裂解人Glu-纖溶酶原的Arg561-Val562肽鍵使之變成有活性的纖溶酶，從而發揮其間接溶解纖維蛋白的作用。GBV-PA與組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA）在結構上具有顯著的差異：t-PA分子由F區(finger domain)、EGF區(epidermal growth factor domain)、Kringle1、Kringle2區及蛋白酶區組成。t-PA的分子結構特點決定了其和纖溶酶原都能結合在纖維蛋白表面上[8，9]，故纖維蛋白能夠加強t-PA的催化活性。GBV-PA分子缺乏F區、EGF區及Kringle1、Kringle2區，僅含有蛋白酶區。GBV-PA結構的特異性使其具備自身的作用特點：(1)半衰期明顯延長 因為F區、EGF區和Kringle1區與肝臟代謝及清除密切相關，GBV-PA缺乏這些區域，不易被肝臟所代謝，所以半衰期較長。本實驗中測定GBV-PA經動脈給藥消除半衰期約為122min，較t-PA半衰期5min明顯延長。半衰期延長可以增加溶栓劑作用時間，增強溶栓效果。(2)GBV-PA不受生理抑制劑的影響，這主要是因為GBV-PA分子的N末端缺乏一系列帶正電荷的氨基酸，即Lys-His-Arg-Arg(KHRR)和Arg-Arg-His-Arg(RRHR)序列，而這正好是內源性抑制劑PAI-1(plasminogen activator inhibitor 1)的結合位點，因此GBV-PA對PAI-1不敏感，不易被PAI-1滅活。Bruad S[10]的研究表明，TSV-PA正是由于缺乏KHRR和RRHR序列，因而能逃脫絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用。(3)高度的底物特異性 GBV-PA只專一地作用于纖溶酶原，不能直接降解纖維蛋白原，也不作用于凝血酶原、蛋白C、第X因子等其他的血漿因子[4]，因而對血液凝血系統影響較小。本實驗結果GBV-PA中、小劑量組僅使TT、PT、APTT輕度延長，但與陰性對照組無顯著差異顯示其對凝血系統較小的影響。(4)較小劑量即可發揮其活性作用，此特點是由其高度的底物特異性所決定。福建醫科大學蛇毒研究所進一步研究還發現GBV-PA可抑制二磷酸腺苷（ADP）或凝血酶誘導的血小板聚集[11]，這一作用特點對于防止溶栓后栓塞動脈的再狹窄具有重要的意義。本實驗研究中，GBV-PA大劑量組溶栓后120分鐘栓塞動脈再通率與瑞替普酶組無顯著差異，顯示了GBV-PA良好的溶栓能力。GBV-PA對血液PT、APTT的延長作用不明顯，對血液中纖維蛋白原的減少作用明顯小于尿激酶，顯示了GBV-PA溶栓過程中較小的副作用。

根據藥代動力學定律[12]，蛋白酶類藥物在體內按照一級動力學代謝，即藥物濃度按恒定比例轉運和轉化。短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑屬于蛋白酶類，其代謝亦應符合一級動力學特點。本實驗中GBV-PA大劑量組溶栓后血管再通率高于中劑量組，中劑量組又高于小劑量組。上述結果說明GBV-PA動脈溶栓效果呈劑量依賴性：在一定范圍內，給藥劑量越大，溶栓效果越好。

通過以上實驗，可以得出結論：GBV-PA動脈溶栓效果呈劑量依賴性；GBV-PA(75μg/kg)與瑞替普酶（0.3mg/kg）溶栓效果相當，比尿激酶(6000U/kg)具有更強的溶栓作用，但副作用較尿激酶為小；

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Experimental study of thrombolysis in artery by plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom(GBV-PA)

WANG Ning-jun, YANG Wei-zhu, JIANG-Na, ZHENG Qu-bin, HUANG Jing-yao, HUANG-Ning, SHEN-Quan
Department of Medical Imaging,Beijing Jingmei Group General Hospital,Beijing,102300,China;
Department of Interventional Radiology, Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China

Objective To observe the relationship between thrombolytic effect and doses of plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom (GBV-PA); To evaluate the intraarterial thrombolytic effect of plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom(GBV-PA) compared with reteplase(r-PA) and urokinase(UK). Methods The model of acute left cerebral embolism was established with interventional technique in 36 adult beagle dogs,which were randomly divided into 6 groups,including control group,reteplase group, urokinase group, GBV-PA high-dose group(75μg/kg),middle-dose group (37.5μg/kg) and low-dose group(18.75μg/kg). Each group was dealt with by correspongding thrombolyticsrespectively.Angiography of left internal carotid artery were performed after thrombolysis 60,120,180,240 minutes to observe the recanalization of embolized arteries.Blood samples were collected to determine thrombin time (TT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time(APTT),fibrinogen(FIB)and D-Dimer(DD). Results (1)The recanalization rate after thrombolysis 2 hours was 86.7% in GBV-PA high-dose group,52.4% in GBV-PA middle-dose group, 33.3% in GBV-PA low-dose group and 0.00% in control group. There was significant statistical difference between every two-groups. (2)The recanalization rate after thrombolysis 2 hours was 88.9% in reteplase group, 86.7% in GBV-PA highdose group and 57.9% in urokinase group. The vascular recanalization rate in GBV-PA high-dose group and reteplase group was higher than that in urokinase group. There was no significant statistical difference in vascular recanalization rate between GBV-PA high-dose group and reteplase group. Conclusion The thrombolytic effect of GBV-PA was dose-dependent;The thrombolytic power of high-dose GBV-PA was stronger than that of urokinase.But there was no significant difference in vascular recanalization rate between high-dose GBV-PA and reteplase.

plasminogen activator of Gloydius Brevicaudus venom; urokinase; reteplase; thrombolysis; artery

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.11.031

北京 102300 北京京煤集團總醫院影像科（王寧軍）福建 350001 福建醫科大學附屬協和醫院介入科（楊維竹 江娜 鄭曲彬黃兢姚 黃寧 申權）

楊維竹 E-mail：ywzjn@sina.com