乙肝病毒大蛋白在乙型病毒性肝炎診斷中的臨床意義

劉春在 馮忠軍

乙型肝炎(乙肝)是我國發病率較高的傳染病之一,已經成為危害廣大人民群眾健康的社會公眾性問題,近年來隨著對乙肝表面抗原大蛋白中前S區抗原在乙肝發病機制、感染與復制等方面研究的深入,研究者們逐漸認識到乙肝表面抗原前S區具有越來越重要的臨床意義[1-3]。HBV S基因編碼合成的HBV外膜蛋白由 3種蛋白組成,包括小蛋白、中蛋白和大蛋白。小蛋白即 HBsAg,中蛋白即 HBsAg和 PreS2Ag,乙肝病毒大蛋白(HBV-LP)即 HBsAg,PreS2Ag和 PreS1Ag。研究發現HBV-LP前 S區在空間上具有獨特的雙重拓撲結構,在包膜內側可以和HBV核殼體膜結合,外側可與易感受體結合,是HBV顆粒成熟包裝的關鍵[4]。由于單獨的前S區抗原作為乙肝表面抗原大蛋白的一部分,無法模擬其復雜的拓撲結構,通過此方法制作的單克隆抗體只具有線性表位,這種針對低級結構抗原制作出的單克隆抗體在實際運用中便有可能造成漏檢。我們利用構象型前 S區的高親和力、高特異性的單抗來檢測血清 HBV-LP以及比較其與HBV DNA以及前 S1抗原(PreS1Ag)的檢出情況,驗證HBV-LP在乙肝診治中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 416份血清標本均來自 2006年 3月至 2007年 2月河北醫科大學第三醫院門診或住院的乙肝患者,男 296例,女 120例;年齡 3～79歲,平均年齡 36.2歲。所有病例選擇均符合 2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會制定的《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標準[5],并排除合并感染其他病毒性肝炎,排除心、腦、腎、肺等器官疾病及高血壓、糖尿病等。其中 HBV DNA陽性血清標本 253份。

1.2 試劑與儀器 試劑：HBV-LP酶免定量檢測試劑盒由北京熱景生物技術有限公司提供;乙肝病毒標志物(HBV M)檢測試劑盒來自廈門英科新創生物有限公司;PreS1Ag檢測試劑來自上海阿爾法公司;PreS2Ag檢測試劑由北京肝炎試劑研制中心提供;HBV DNA熒光定量試劑盒由廣州達安基因股份有限公司提供;所有試劑均在有效期內使用。儀器：芬蘭 Labsystems Dragon公司的Wellscan MK 3全自動酶免分析儀;北京普朗新技術有限公司生產的洗板機;美國 ABI公司的 7000全自動熒光PCR儀。

1.3 檢測方法與結果判定 HBV-LP檢測采用ELISA雙抗體夾心法,定量時用定值標準品 0、10、25、50、100、200 ng/ml,通過由全自動酶免分析儀測定結果。HBV DNA熒光定量測定采用FQ-PCR,其含量小于 1.00×103copies/m l時判為陰性,反之判為陽性。HBV M、HBV preS1Ag、HBV preS2Ag測定均采用ELISA法,定性結果判定均嚴格按試劑說明操作,由全自動酶免疫分析儀自動判讀。

1.4 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件,計數資料采用χ2檢驗,血清 HBV-LP水平與 HBV DNA對數值之間相關性采用相關分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV-LP濃度均值與 HBV DNA相關比較 HBV-LP濃度均值與 HBV DNA含量(拷貝數對數)呈正相關性(r=0.358,P＜0.05),回歸方程為 Y=0.5679X+3.5618。見表 1。

2.2 416例標本中HBV-LP以及 PreS1Ag檢出情況比較 416例 HBV DNA標本中,HBV-LP陽性檢出率為 85.34%(355/416),PreS1Ag陽性檢出率為 67.79%(282/416),差異有統計學意義(χ2=35.694,P＜0.05)。其中 30.29%(126/416)的患者 HBV-LP檢測結果為陽性而 HBV DNA為陰性。見表 2。

2.3 HBV-LP與 HBV DNA、HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag相關性 HBV-LP與 HBV DNA、HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag的陽性符合率分別為 54.55%、90.0%、86.96%;HBV-LP與 HBV DNA,HBV PreS1Ag,HBV PreS2Ag間 相關顯著 (χ2=4.793、3.927、6.769,P＜0.05);HBV-LP與 HBV DNA、HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag間存在差異顯著性(χ2=20.091,14.769,17.920,P＜0.05)。 HBV-LP的檢出率為 72.73%,較 HBV DNA、HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag高。見表 3。

表 1 253例乙肝患者中 HBV DNA拷貝數與 HBV-LP濃度關系

圖 1 不同 DNA拷貝數與 HBV-LP濃度均值相關性

表 2 416例標本中 HBV-LP和 PreS1Ag陽性檢出情況比較 例

表 3 44例 HBV感染者血清 HBV-LP與定性檢測指標的相關性 例

表 4 HBeAg陽性和陰性標本中 HBVDNA、HBV-LP和PreS1Ag檢出比較 例(%)

2.4 HBeAg陽性和陰性模式中 HBV-LP與 HBV DNA、PreS1Ag比較 174例乙肝患者HBeAg陽性組中,HBV-LP濃度和 HBV DNA含量差異無統計學意義(χ2=1.251,P＞0.05);HBV-LP和 HBV PreS1Ag間差異無統計學意義(P＞0.05)。242例乙肝患者 HBeAg陰性組中,HBV-LP和 HBV DNA,HBV PreS1Ag間差異均有統計學意義(χ2=69.308、8.500,P＜0.05);HBVLP的檢出率明顯高于 HBV DNA(80.17%,43.39%)。見表 4。

3 討論

乙肝病毒的包膜蛋白稱為 HBsAg,是決定病毒吸附至易感細胞受體的成分,編碼包膜蛋白的基因可分為 S,PreS2和PreS1,包膜蛋白由三種蛋白組成,即大、中和小蛋白。細胞受體的成分,編碼包膜蛋白的基因可分為 S,PreS2和 PreS1,包膜蛋白由三種蛋白組成,即大、中和小蛋白。Bruns等[6]通過研究鴨乙肝病毒血清的感染性不僅依賴于具有感染性的病毒顆粒(Dane顆粒)的多少,而且還依賴于缺乏核酸的亞病毒顆粒的數量,研究發現亞病毒顆粒在HBV感染過程中,能顯著的增強細胞內的病毒的復制和基因表達,而這種增強作用是由 HBVLP前 S區反式激活作用觸發的。Foo等[7]證明HBV-LP是導致肝細胞損傷、死亡和纖維化病變的主要原因,因此檢測 HBVLP對于反映病毒持續復制、預后有重要的臨床意義。

數據顯示 ELISA檢測 HBV-LP濃度均值與HBV DNA含量(拷貝數對數)具有良好的正相關性(r=0.358,P＜0.05),表明乙肝患者體內 HBV-LP與病毒復制密切相關,提示檢測HBV-LP能準確反映出患者體內病毒復制情況。

研究還顯示,在 416例 HBVM陽性的標本中HBV PreS1Ag檢出陽性率為 67.79%,低于 HBV-LP的陽性率(85.34%),兩者差異有統計學意義(χ2=35.694,P＜0.05)。其中 30.29%(126/416)的患者檢測結果為HBV-LP陽性而HBV DNA陰性,原因可能是：(1)由于 HBV具有適應性和變異性傾向,導致HBV基因變異頻繁,已經設計好的商品化 PCR引物有一定的漏檢率,而HBV-LP檢測是采用單克隆抗體特異識別,受基因變異的影響較少;(2)含有 HBV-LP的亞病毒顆粒(管狀顆粒)的數量是完整病毒顆粒的10 000倍以上,血液中消退時間也晚于 HBV DNA[8];(3)近年來,抗病毒藥物應用廣泛,但是目前的抗病毒藥物只能抑制HBV DNA復制,并不能抑制已經形成的病毒表達蛋白質,即并不減少前基因組RNA和 mRNA,提示以病毒 DNA為模板的轉錄和病毒蛋白的轉譯表達不受影響,因此血清 HBV DNA下降的速度可能遠快于 HBV-LP。

44例標本中 HBV-LP在 HBV感染患者血清中較 HBV DNA、HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag敏感,原因可能是 HBV-LP檢測采用的是針對立體構象型表位的單克隆抗體,HBVPreS1、HBVPreS2作為HBV-LP的一部分,無法模擬其復雜的雙重拓撲結構,在制作單克隆抗體時由于序列的折疊、卷曲而失去表位暴露的機會導致漏檢。提示檢測含構象前 S區的 HBV-LP比單獨檢測 HBV PreS1Ag更能準確反映出患者體內病毒復制情況。另一個原因是 HBV突變株不斷增加,HBV DNA檢測的方法學與靈敏度缺陷等使HBV DNA陰轉并不能真實反映肝組織內 HBV感染及復制情況,尤其是HBV DNA低水平時,肝內HBV DNA仍可維持一定水平;目前抗病毒治療只能抑制cccDNA再復制,富含大蛋白的亞病毒顆粒在一定時間內仍存在。

HBeAg是HBV感染與復制重要的血清學指標,反映了機體的免疫狀態[8]。HBeAg轉陰是急性乙肝有效治療的監測指標,但由于HBV基因前C區或CP區發生變異可以導致其合成障礙,而乙肝病毒仍然活躍復制,在較多的 HBeAg陰性慢性乙肝患者中仍然呈現 HBV DNA檢測陽性的結果[9],進而其轉陰并不能排除病毒的復制與傳染性。本研究HBeAg陰性的 242例標本中 HBV DNA的陽性率是 43.39%。研究還發現,HBVLP與 HBV DNA之間均關聯顯著(P＞0.05)。HBeAg陽性組中 HBV-LP與 HBV DNA間差異無統計學意義(P＜0.05);HBeAg陰性組中HBV-LP與 HBV DNA差異有統計學意義(P＜0.05);HBV-LP檢出率為 80.17%,高于 HBV DNA的檢出率,與樂愛平等[10]的研究一致。這說明 HBV-LP的檢測能提早診斷出 HBeAg陰性慢性乙肝患者體內HBV復制情況,有利于及時治療,能有效避免肝硬化、肝癌的發生。

目前 HBV DNA檢測是HBV復制最直接的指標,但此方法對實驗室條件要求嚴格,不易推廣,特別是廣大基層醫療單位還難以開展。乙肝兩對半的血清免疫學標志物,可以反映乙肝患者的病情和傳染性,現已作為常規檢測項目開展,但是由于其方法的靈敏度、特異性的限制以及 HBV為逃避宿主的免疫反應常發生變異,導致檢測結果的失真。而使用酶聯免疫定量方法檢測 HBV-LP與 HBV DNA的檢測有良好的一致性,是反映 HBV復制活躍的可靠指標,可以作為 HBV感染、復制和乙肝患者診斷、治療和預后的重要標志物,適合于各級醫院開展。

1 Bruss V,Vieluf K.Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Particle Morphogenesis.J Virol,1994,69：6652-6657.

2 Bruss V.Envelopmentof the hepatitis B virus nucleocapsid.Virus Res,2004,106：199-209.

3 Labert C,Mann S,PrangeR.Assessmentof determ inantsaffecting the dual topolopyofhepadnaviral large envelope proteins.Journalof General Virology,2004,85：1221-1225.

4 Heermann K,Goldmann U,Schwartz W,et al.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pro-S sequence.JVirol,1984,52：396-402.

5 病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志,2001,19：56-62.

6 Bruns M,Miska S,Chassol S,et al.Enhancement of hepatitis B virus infection by noninfections subviral particles.JVirol,1998,76：1462-1468.

7 Foo NC,Ahn BY,Ma X,et al.Cellular vacuolization and apoptosis induced by hepatitis B virus large surface protein.Hepatology,2002,36：6.

8 Yamada T,Iwabuki H,Kanno T,et al.Physicochemical and immunologicalcharacterization of hepatitis B virusenvelope particlesexclusively consisting of the entire L(pre-S1+pre-S2+S)protein.Vaccine,2001,19：3154-3163.

9 Hamasaki K,Nakata K,Nagayama Y,et al,Change in prevalence of HBeAg negative mutant hepatitis B virus during the course of chronic hepatitis B.Hepatology,1994,20：8-14.

10 樂愛平,鞠北華,胡慶宏.HBV PreS1-Ag、HBV PreS2-Ag、HBV DNA、HBV M的相關性分析及其意義.臨床肝膽病雜志,2003,19：344-346.