乳酸對酵母凋亡及某些相關基因表達的影響

盧 麗，李樹峰，佟慧麗，馮 霞，徐婷婷，嚴云勤

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

細胞凋亡（Apoptosis）是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式，指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程[1-2]。細胞凋亡研究一直以動物細胞為模型，取得了很多成果。但由于動物細胞代謝通路復雜且具有種屬和時空特異性，發展到一定階段給研究帶來了困難。

自1997年madeo等首次報導了酵母細胞的凋亡后，使人們認識到，不僅多細胞真核生物可發生凋亡，單細胞真核生物也可發生凋亡，并且像酵母這樣的單細胞生命凋亡能很好地簡化研究過程[3]。此后研究發現，多種外源因素均能導致酵母細胞凋亡，如H2O2、次氯酸、阿司匹林、乙酸、NaCl、葡萄糖等。隨著研究的深入，人們發現酵母基因組編碼很多執行細胞死亡基本分子機制的蛋白質，如凋亡蛋白抑制因子IAP（Bir1）和與線粒體相關聯的caspases、Aif、HtrA2/Om（iNma111）等[4-5]，有的酵母凋亡中還涉及線粒體中的Fis1、Nuc1、Ndi1[6]，活性氧（ROS）在酵母凋亡中也起著重要作用。由不同因素引起的酵母凋亡，可能具有不同的分子機制。由于酵母與多細胞動物凋亡的相似性，酵母作為一種簡單的生物模型體系，可能有助于闡明和發現新的凋亡調節機制。

乳酸是某些特殊酵母發酵的正常終產物，在釀造啤酒時，加入適量乳酸既能調整pH促進糖化，有利于酵母發酵，提高啤酒質量，又能增加啤酒風味，延長保質期。在白酒、清酒和果酒中乳酸可用于調節pH，防止雜菌生長，增強酸味和清爽口感。在某些方面，乳酸與酵母有著很大的關聯，所以，研究乳酸對酵母凋亡的影響及其相關基因的表達變化，可指導生產實踐中對乳酸的應用，同時為其凋亡通路的深入研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株Y187由朱延明教授實驗室惠贈。

1.1.2 試劑

溶細胞（Lytiase酶）購自Solarbio；Taq酶和其他PCR試劑（購自寶生物工程（大連）有限公司）；TUNEL試劑盒（購自Promega公司）；反轉錄試劑盒（購自康為生物有限公司）。其他常規試劑均為進口分裝或國產分析純。

首先使用水利普查基層登記臺賬管理系統菜單中的“對象清查清查瀏覽”功能，點擊業務分類的每一項，通過“導出EXCEL”功能，分別形成與Q201～Q803內容對應的24張瀏覽表，如表Q201（水庫工程）導出名為“VIEW_Q201_0.XLS”。為了避免數據的無序性和方便后面的操作，應在軟件中先按水利普查自動生成的編碼排序后再導出數據。

1.1.3 引物

所有引物均用primer5.0軟件設計，上海生工公司合成，所設計引物序列、退火溫度和擴增片段大小如下:

1.2 方法

1.2.1 酵母生長曲線的測定

酵母生長曲線的測定方法參照文獻[7]。

1.2.2 乳酸處理酵母

當YPD液體培養基中的酵母細胞處于指數生長前期（OD=0.6～0.9）時，調pH 3.0后，分別加入0、200、250、300 mmol·L-1的終濃度乳酸培養 200 min，而250 mmol·L-1終濃度的乳酸分別培養120、200、260 min。

1.2.3 酵母細胞死亡與凋亡的檢測

酵母細胞死亡檢測采用美蘭染色法[7]。酵母細胞的檢測采用DAPI染色法、PI染色法、TUNEL染色法[8-10]。RT-PCR法檢測一些凋亡相關的基因表達按試劑盒指南操作。

1.2.4 數據處理與分析

RT-PCR結果經Glyko BandScan4.3進行OD值掃描后，數據采用DPS7.05軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 酵母細胞的生長曲線和死亡率檢測結果

2.1.1 酵母細胞的生長曲線

采用分光光度計法測量酵母細胞的生長曲線，培養8 h左右，酵母生長開始進入指數期，隨后培養到約18 h這個區間，酵母細胞生長迅速，基本呈幾何級數生長。培養20 h后，酵母細胞生長極其緩慢，基本處于停滯狀態，此時，酵母細胞數達到最大值，處于穩定生長期，如圖1所示。

2.1.2 酵母細胞的死亡情況

根據前人試驗結果可知，當酵母細胞被外源刺激3 h后死亡率達到80%～90%時，凋亡的程度最大。所以本試驗通過一系列的試驗選擇200、250、300 mmol·L-1三個乳酸終濃度進行試驗。

用美蘭溶液對酵母細胞進行染色，普通光鏡下觀察到死細胞被染成藍色，而活細胞沒有被染上色。在本試驗中乳酸的三個濃度處理的酵母細胞，酵母細胞的生長被完全抑制，隨著乳酸濃度的增加，死亡比率逐漸增加，200 mmol·L-1終濃度的乳酸處理酵母細胞200 min，約有30%左右的細胞發生死亡；250 mmol·L-1終濃度的乳酸處理120、200和260 min時，酵母的死亡率在55%～62%之間；當乳酸終濃度達到300 mmol·L-1時，處理120 min后，死亡率基本達到90%，該濃度處理的前120 min內，酵母的死亡比率增長很快（見圖2）。

圖1 酵母細胞在YPD培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of yeast cell in YPD culture medium

圖2 乳酸處理酵母細胞的死亡率曲線Fig.2 Mortality rate curve of lactic acid treatment yeast cells

2.2 凋亡情況檢測結果

2.2.1 DAPI染色情況

DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，正常的細胞核核形完整，染色質均勻，當細胞發生凋亡時，染色質固縮，向外周聚集，形成周邊化，緊接著染色質進一步固縮，形成很多顆粒物，最后細胞核破裂形成碎片，核解體。因本試驗中300 mmol·L-1的終濃度乳酸處理200 min可引起90%左右的酵母細胞死亡，如果引起的死亡是以凋亡的形式進行，那么這個條件的死亡率應該凋亡程度最大。所以對可能引起最大凋亡程度的300 mmol·L-1乳酸終濃度處理的酵母進行凋亡檢測。DAPI染色后，在熒光共聚焦顯微鏡下可觀察到酵母細胞發生核斷裂和核降解的凋亡表型（見彩版Ⅰ），核斷裂而產生核擴散的狀態，圖中染色的范圍比對照組的細胞大一些，可以初步確定乳酸能夠引起酵母細胞發生凋亡，但還需做進一步的凋亡驗證。

2.2.2 PI染色情況

酵母細胞進行PI染色后，在熒光顯微鏡下觀察計數統計如圖3所示，對照組的細胞，PI透膜率基本為零，即基本沒有細胞被染色；200 mmol·L-1乳酸處理200 min后PI透膜被染成紅色的細胞僅約2%～4%；引起90%左右死亡率的300 mmol·L-1乳酸處理200 min后的檢測結果僅有少于10%的細胞被染色?？梢?，本試驗設置的三種乳酸濃度的PI透膜率相比于細胞的死亡率是非常小的一部分，基本可以忽略。由于PI僅能透過壞死細胞的細胞膜而對核染色，但細胞發生死亡而沒有被PI染色，說明大部分死亡細胞的細胞膜并沒有遭到破壞，這符合凋亡發生的情況，所以進一步確定是凋亡作用的結果。

圖3 不同終濃度乳酸處理酵母細胞200 min的透膜率Fig.3 Through membrane rate of different densities of final lactic acid treatment yeast cells in 200 min

2.2.3 TUNEL染色情況

TUNEL是一種用來檢測細胞凋亡的分析方法，細胞凋亡時內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生。酵母細胞進行TUNEL染色后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，對照組的酵母細胞沒有顯示TUNEL陽性。200 mmol·L-1終濃度乳酸處理酵母細胞200 min，TUNEL陽性率不到30%，當終濃度達到300 mmol·L-1時，TUNEL陽性率可達到80%以上，可見隨著乳酸濃度的增加TUNEL的陽性率逐漸增加（見彩版Ⅱ）。由250 mmol·L-1的終濃度乳酸處理培養酵母細胞不同時間，不同培養時間在本試驗設置的這3個時間梯度中內TUNEL陽性率基本都在60%作用左右，隨著處理時間的延長，TUNEL的陽性率并沒有顯著變化。TUNEL檢測結果表明通過以上的凋亡檢測基本可以斷定，乳酸引起的酵母細胞死亡是以凋亡的形式進行，其凋亡程度隨乳酸處理濃度的增加而增加，但與乳酸處理時間無明顯改變。

2.3 RT-PCR檢測相關基因的表達

圖4 不同濃度乳酸對酵母細胞基因表達的影響Fig.4 Effect of different densities of lactic acid on gene expression of yeast cells

本試驗選擇了線粒體中與凋亡相關的幾個蛋白基因（Yca1、Aif1、Nma111、Nuc1、Ndi1、Fis1、SOD1、SOD2）和酵母中唯一的凋亡蛋白抑制因子Bir1。通過RT-PCR法檢測這幾個基因的表達量變化，結果表明，隨著乳酸終濃度的增加及凋亡程度的增加，得到Fis1、Bir1、SOD1、SOD2四種基因的表達量隨之降低且差異顯著（P＜0.05）（見圖4）。圖中第1泳道的對照組中，四種基因均有表達，隨著乳酸處理濃度（即凋亡程度）的增加，這四種基因的表達都呈遞減趨勢，而且1與2，2與3，3與4間的差異均顯著（P＜0.05）；當乳酸終濃度達到300 mmol·L-1引起約80%以上的凋亡時，這四種基因的表達量最低。但處理時間的增加對這四種基因表達并沒有顯著改變（P＞0.05）。Yca1、Aif1、Nma111、Nuc1、Ndi1基因的表達隨著處理濃度和時間的增加都沒有顯著變化（P＞0.05）。

3 討論

醋酸、酒精等多種外源刺激可引起酵母凋亡，顯現與動物相似的凋亡表型，乳酸作為酵母發酵的產物之一和工業添加劑影響酵母的作用價值，但其對酵母凋亡的影響還未見報道。近年來的研究表明，在酵母的凋亡過程中線粒體、Yca1和ROS具有中心作用[12]，凋亡蛋白抑制因子Bir1具有重要調控作用，所以在乳酸引起的酵母凋亡中，檢測線粒體中的相關基因、ROS相關基因和Bir1基因表達變化，對細胞凋亡理論研究及指導生產實踐有一定的理論意義和實際應用價值。

在本試驗條件下，200 mmol·L-1的乳酸已經完全抑制酵母細胞的生長并使細胞死亡，隨著處理濃度的增加，酵母細胞的死亡率隨之增加。DAPI染色可知，乳酸引起酵母細胞核斷裂和核降解，這是凋亡細胞的特征；能夠區分壞死和凋亡的PI染色表明，幾乎所有死亡的酵母細胞膜并沒有破壞，乳酸引起的酵母細胞死亡屬于細胞凋亡；TUNEL染色進一步證明，乳酸引起的酵母細胞死亡是以凋亡的形式進行，而且，隨著乳酸處理濃度的增加，酵母的凋亡程度也隨之增加。但是隨著處理時間的延長，酵母細胞的死亡率和凋亡率都無顯著變化，這種無時間依賴性的原因可能是乳酸對酵母的損傷在處理的2 h內乳酸的毒性已經發揮作用，2 h后并沒有進一步的損傷積累。

采用RT-PCR方法分析線粒體中的一些基因和酵母中唯一的凋亡蛋白抑制因子Bir1的基因表達變化，結果表明，隨著凋亡程度的增加Fis1、Bir1、SOD1、SOD2四個基因的表達量隨之降低。Fis1p在線粒體斷裂中起作用，也顯示抑制凋亡的功能，如Fis1酵母突變株經H2O2處理后凋亡程度增加[6]。Fannjiang等研究表明，酵母Fis1p的抗凋亡功能能被Bcl-2或bcl-xl功能性替換，暗示Fis1p以類Bcl-2方式作用[13]。而本試驗中Fis1基因表達的降低，可能是其在凋亡的過程中起著一個類Bcl-2的作用，具體作用機制有待深入研究。Bir1p是酵母中凋亡蛋白抑制因子IAP家族的唯一成員，抑制下游的caspase，Bir1p顯示抗凋亡功能，酵母細胞缺少Bir1p顯示典型的凋亡特征及ROS的產生[4]。本試驗中Bir1基因表達的下降可能調節加強了Yca1p的激活從而促使凋亡發生；Yca1基因的表達沒有顯著變化，它對凋亡的作用還有待于深入檢測其蛋白活力變化。對線粒體中的Aif1（凋亡誘導因子）、Nma111（細胞凋亡核介導因子Htra2/Omi類蛋白）、Nuc1（核酸內切酶）、Ndi1（人類細胞AMID的酵母同源物）的檢測并沒有得到顯著的變化，為進一步闡明這些蛋白在乳酸誘導凋亡中的作用，還需進一步檢測其蛋白活力，或采用構建突變株的方法來進行檢測。

本試驗中在乳酸處理培養120～260 min酵母凋亡的黃金時間內，隨著凋亡程度的增加，SOD1（細胞質超氧化物歧化酶）、SOD2（線粒體超氧化物歧化酶）基因的表達隨之降低。Fabrizio等研究在酵母中任意過表達SOD1或SOD2可增加其壽命，酵母的長期生存需要這二者[14]，但乳酸處理使酵母凋亡，壽命縮短，可能因此使SOD1和SOD2的表達降低。本試驗所檢測的各基因在酵母凋亡過程中的相互關聯及其作用機制尚需深入研究。

4 結論

a.乳酸引起的酵母細胞死亡具有劑量依賴性，無時間依賴性。

b.經DAPI、PI、TUNEL染色證明，乳酸引起的酵母細胞死亡是以凋亡的形式進行。

c.RT-PCR檢測表明，與凋亡相關的Fis1、Bir1、SOD1、SOD2基因的表達量隨著凋亡程度的增加而降低。

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