城市污泥堆肥過程中纖維素降解菌的篩選及鑒定

崔麗娟，申雪慶，周東興

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

纖維素是地球上最豐富、數量最大的可再生資源[1]，占全球植物總干重的30%～50%[2-3]。據不完全統計，全世界每年因廢棄物焚燒造成的直接經濟損失達數十億元，利用率低（10%左右）[4-7]。目前，在利用生物學方法來處理廢棄物方面，主要存在的問題是缺少高效分解木質纖維素類物質的微生物及其發酵工藝[8]，受成本的限制。近年來，生物學方法利用纖維素類固體降解廢棄物取得了一定的突破[9]，具有很好的應用前景。

在纖維素分解菌的篩選及性狀研究方面，國內外相關報道很多，種類從真菌，放線菌到細菌均有所涉及[10-11]。Peter等曾列舉總結出一系列的纖維素分解菌，大部分都是厭氧菌，其中只有3種是好氧菌[12]。利用微生物發酵堆肥方法是處理城市污泥的途徑之一。通過微生物的分解作用，可以把城市污泥和作物秸稈等轉化為優質的有機肥。城市污泥是一種可以再利用的有機固體廢棄物，其物理特性為絮狀體結構，脫水性差，分散困難[13-14]，不利于好氧發酵的順利進行，需要添加碳源（如稻殼、秸稈等），同時可增加發酵物料的孔隙度。目前在如何快速降解城市污泥和農業廢棄物發酵過程中纖維素的應用和作用研究方面，報道較少[15-16]。

本研究旨在在城市污泥和稻殼混合物料發酵過程的升溫階段篩選出高效纖維素降解菌，為污泥堆肥的生物處理提供原始菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

哈爾濱文昌污水處理廠的脫水污泥，進行好氧發酵，在發酵的升溫階段進行取樣。好氧發酵設備為自行研制的臥式旋轉式污泥好氧發酵裝置。

1.2 培養基

①纖維素剛果紅培養基參見文獻[17-18]；②赫奇遜培養液，內放濾紙條（1 cm×6 cm）；③羧甲基纖維素培養基；④PDA培養基；⑤液體發酵培養基:水解酪素0.5 g，蔗糖15.0 g，酒石酸銨5.0 g，NH4NO31.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.1 g，蒸餾水1000mL。

1.3 菌種分離

樣品用無菌水作梯度稀釋，室溫160 r·min-1振蕩30 min。取10-9稀釋度的菌懸液涂布于纖維素剛果紅培養基初篩，置于37℃恒溫恒濕培養箱中培養，挑取生長快、紅色濃郁且透明圈大的培養物，以濾紙為唯一碳源的赫奇遜培養液進行復篩，將濾紙分解速度快的培養物挑選出來，在羧甲基纖維素培養基上反復劃線直至得到純菌株，以此作為目標菌。另接種PDA斜面保存。

1.4 菌株的生長速率測定

挑選出的菌株接種于剛果紅平板培養基中央，置于37℃下恒溫恒濕條件下培養6 d，每天測定水解圈直徑的大小，計算水解圈直徑與天數的比值，以cm·d-1表示平均生長率。

1.5 菌株對纖維素降解能力測定

將生長速度快及水解圈大的菌株接種于赫奇遜培養液中，以不接種處理作對照，37℃、120 r·min-1搖床培養 10 d，分別在第 3、5、7、10天時測定其濾紙失重率。方法為用濾紙過濾發酵液，將殘留物80℃烘干稱重，用減重法計算出濾紙失重率。

1.6 菌種鑒定

1.6.1 形態觀察及鑒定

將目標菌接種至PDA斜面，37℃倒置培養72 h，觀察菌落形態，正反面顏色。真菌鑒定主要依據文獻[19-20]，以菌落特征和形態學特征為主。形態特征以菌絲體的形狀為主。經處理后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.6.2 rDNA-ITS序列的PCR擴增、序列分析及系統發育樹的構建

該方法不僅用于分類鑒定，還可對菌種類群作系統發育分析[21]。液氮研磨液體發酵后的菌絲球，提取基因組DNA[22]，采用真菌通用引物擴增內轉錄間隔區的保守序列，正向引物:5′TCCGTAGGTG AACCGTCGG 3′，反 向 引 物 : 5′TCCTCCGCTTA TTGATATGC 3′；PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min，30個循環，72℃延伸10 min，4℃冷卻中止反應。瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物的測序由大連寶生物工程有限公司完成，所得序列通過Blast程序與GenBank中的核酸數據進行比對分析。用MEGA4.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的生長速率

將復篩得到的菌株接種于剛果紅纖維素瓊脂平板，測定透明圈直徑，與天數的比值表示其生長速率，該比值可說明產纖維素酶量的高低或酶活性的強弱。測定結果見表1，該比值可大致說明產纖維素酶量的高低或酶活性的強弱。通過對比值大小進行比較，可以判斷各不同的菌株間降解纖維素能力的差異。分析結果為C、B、E生長速率較快。對初篩與復篩的結果進行綜合分析，判斷B、E菌株為目標菌種。

2.2 菌株對纖維素的降解能力

對照為未添加菌株的赫奇遜培養液，在30℃搖床培養10 d后無任何變化。對5個菌株進行濾紙失重試驗得出結論:菌株B和E對底物濾紙的降解率最高，分別為53%和39%。結果見表2。

2.3 形態特征

篩選出來的5種菌株的菌落形態特征見表3。

表1 菌株在剛果紅纖維素瓊脂平板上的生長情況Table1 Growth of the strains on cellulose-congo red medium

表2 不同培養時間的濾紙失重率Table2 Ratio of weight losing of filter paper in different time （%）

表3 菌株的菌落形態觀察Table3 Colony morphological characteristics of strain

電鏡圖片及PDA斜面生長情況見圖1～5。由圖1～5可見，各菌株的形態特征A:絲狀菌絲體，易挑取，正反面顏色不一致，形成孢子囊，產生子囊孢子，菌絲有橫隔，孢子繁殖；B:白色菌落，絮狀，致密、扁平、干燥、不易挑取、生長迅速，正反面顏色一致，不形成孢子，以菌絲斷裂方式繁殖，菌絲表面有刺狀突起，有橫隔，菌絲直徑5μm；C:生長緩慢，初期白色菌落，后期形成有顏色的孢子，孢子直徑20μm，此為放線菌菌落特征；D:菌絲疏松，綠色，正反面顏色一致，孢子紡綞形，表面不光滑；E:菌絲體橙黃色，絲狀，生長迅速，無分枝，孢子表面有皺紋，近球形。孢子直徑40μm，菌絲直徑70μm，有橫隔，極易挑取。

圖 1 A菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.1 A by scanning electron-microscope

圖 2 B菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.2 B by scanning electron-microscope

圖 3 C菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.3 C by scanning electron-microscope

圖 4 D菌株的掃描電鏡圖(×8500，×2000)Fig.4 D by scanning electron-microscope

圖 5 E 菌株的掃描電鏡圖（×1000，×2000）Fig.5 E by scanning electron-microscope

2.4 菌株B和E的形態學鑒定

對篩選出的5個菌株，針對降解纖維素效果較好的菌株B和菌株E進行了形態學鑒定。根據菌落形態及菌體特征判斷，菌株B和E為兩株真菌。對兩株真菌進行rDNA-ITS序列解析（測序結果略），分別獲得GenBank登錄號FJ824032和FJ824033。系統進化樹重建結果及鑒定結論

將所測得序列在NCBI數據庫中進行相似性搜索（BLAST），選取其中已經發表的，相似性較高的序列，與B和E的菌株序列以鄰接法構建系統進化樹，所用程序為MEGA4，分析進行1000次重復。

采用通用引物IST1和ITS4，對菌株的基因DNA擴增獲得了片段大小為505bp的ITS片段，對上述PCR擴增產物進行序列測定，該菌株的保守序列在NCBI網站上進行同源性比較，發現與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的高度相似，相似性達到100%。說明兩者有特別近的親緣關系。菌株B獲得GenBank登錄號為FJ824032（見圖6）。

采用通用引物IST1和ITS4，對菌株的基因DNA擴增獲得了片段大小為549bp的ITS片段，對上述PCR擴增產物進行序列測定，該菌株的保守序列在NCBI網站上進行同源性比較（BLAST），發現該菌株的保守序列與脈孢菌（Neurospora sp.）高度相似，達到99%以上，認為兩者有特別近的親緣關系。菌株E獲得GenBank登錄號為FJ824033（見圖 7）。

圖6 菌株B基于rDNA-ITS區序列重建的系統進化樹Fig.6 Phylogeng tree of B based on rDNA-ITS sequence

圖7 菌株E基于rDNA-ITS區序列重建的系統進化樹Fig.7 Phylogeng tree of E based on rDNA-ITS sequence

3 討論與結論

纖維素是地球上非常豐富的可再生性資源，如農業生產中產生的秸稈，以及城市污泥當中存在的，若將這些物質充分利用好，則每年能夠在很大程度上降低化學肥料的施用量，實現節能減排。但目前主要存在的問題是缺少高效分解木質纖維素類物質的微生物。本研究在好氧發酵過程中篩選出5株纖維素分解菌，對其中兩株降解能力強的菌株通過形態特征觀察、rDNA-ITS序列分析結果表明兩菌株分別為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和脈孢菌（Neurospora sp.），在赫奇遜培養液中培養10 d后濾紙失重率分別達到53%和39%。本試驗利用城市污泥和稻殼做為添加劑和調理劑，對纖維素分解菌進行篩選，促進城市和農村廢棄物的分解和利用，在理論和應用當中具有很重要的實踐意義。

目前，國內外應用較多的是EM菌，該制劑是由80多種微生物復合而成的，應用領域廣，效果較好，利用了多菌株的協同作用。本研究只篩選出了兩株效果較好的微生物菌株，其實際應用效果需要在今后的進一步試驗中驗證。本試驗過程中使用的自制的臥式旋轉式污泥好氧發酵裝置，通過試驗表明，該設備在物料翻轉周期和通風控制上還存在一定問題，需進一步改進，配合篩選出的好氧發酵微生物實現更好的廢棄物處理效果。

rDNA-ITS鑒定是一種很精確的鑒定手段，使我們能夠準確認識篩選出來的微生物種類，為今后的實際生產和產業化目標奠定基礎。下一步研究工作將針對高效分解微生物的進一步篩選和復配，以及實際應用效果研究方面展開。

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