污染土壤中耐鎘菌株的篩選、鑒定及吸附試驗研究

耿印印，王旭梅,*，王紅旗，佟秀春

（1.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030；2.北京師范大學水科學研究院，北京 100875）

鎘是一種比較稀有的金屬，它極易蓄積在土壤中。在目前的重金屬污染中，鎘污染很突出，是面積最廣、危害最大的重金屬元素之一。有資料顯示，我國受鎘污染的耕地面積約1.33萬hm2。鎘對作物和蔬菜會產生毒害作用，并最終在植物可食部分積累而污染農產品，而且可通過食物鏈進入人體。當其超過一定限量時，會對生態環境和人體造成危害。

目前，現有的鎘污染土壤修復方法普遍存在著二次污染、成本高、修復效果不理想等問題。而生物修復技術是最近30年來全球極力研究開發的一種綠色、經濟的環境修復方法，其在治理土壤污染方面的作用越來越受到廣泛的關注。主要包括兩大類:植物修復技術和微生物修復技術。

鎘污染土壤的微生物修復是利用微生物的生物活性對重金屬的親合吸附或轉化為低毒產物，從而降低重金屬的污染程度。在長期受某種重金屬污染的土壤中，生存著很大數量的、能適應重金屬污染環境并能氧化或還原重金屬的微生物類群。一些微生物如細菌、真菌和藻類等對重金屬離子都有很強的耐受性及吸附能力。本文著重研究從鎘污染的土壤中分離馴化耐鎘菌株，并進行吸附試驗研究，進一步選出兩株吸附效果最好的菌株，以期為土壤的鎘污染修復提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

土樣1:采自北京市某工廠車間土；

土樣2:采自北京市某工廠邊緣的土；

土樣1中鎘含量為2.13 mg·kg-1，土樣2中鎘含量為1.23 mg·kg-1，都超過了國家土壤環境質量的三級標準值。具體的理化性質見表1。

表1 土樣的理化性質Table1 Soil physical and chemical properties

1.1.2 培養基

無機鹽培養基:Na2SO42 g，K2HPO46 g，KH2PO45.5 g，KCl 2 g，MgSO47H2O 0.2 g，微量元素 1mL，去離子水定容至1 L，調節pH為7。

牛肉膏蛋白胨液體培養基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水定容至1 L，調節pH為 7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨固體培養基:同牛肉膏蛋白胨液體培養基，加瓊脂1.5%～2.0%。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集

采用五點法，取地下5～10 cm的土壤樣品混合，無菌袋帶回實驗室，風干，研磨過篩，放-20℃冰箱里備用。

1.2.2 菌株的分離、馴化

分別稱取兩種風干污染土1 g，放入盛有100mL無菌水并帶有玻璃珠的250mL的三角瓶中，28℃搖床振蕩30 min，使土樣與無菌水充分混合。取10mL菌液加入到90mL無機鹽培養基中，再搖床振蕩培養5 d。靜置后取10mL培養液逐步轉接于Cd2+濃度分別為10、20、30、40、60 mg·L-1無機鹽培養基中，加入葡萄糖為碳源、硝酸鉀為氮源。28℃搖床振蕩，每次培養7 d，進行馴化。

1.2.3 菌株的純培養

把稀釋10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固體培養基平板，培養一段時間后形成單菌落。挑選長勢好、菌落飽滿的菌株用連續劃線法對細菌純化培養。

1.2.4 菌株的鑒定

以各單菌液為PCR的反應模板，實驗采用的PCR反應引物為16S rDNA細菌通用引物27F（正向引物）、1492R（反向引物）。

PCR擴增反應體系為聚合酶 50μL:2×TaqPCRmasterMix 25μL（0.1 U·μL-1Taq 聚合酶；500μmol·L-1dNTP；20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.3）；100 mmol·L-1KCl；3 mmol·L-1MgCl2），引物 27F（20 mmol·L-1）2μL，引 物 1492R（20μmol·L-1）2μL，模板 2μL，超純水 19μL。

PCR擴增反應條件:94℃預變性6 min，94℃變性30 s，52℃復性40 s，72℃延伸1.5 min，進行30個循環，最后72℃延伸10 min。

5μL PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（90 V，30 min），用凝膠成像系統觀察結果并拍照。擴增產物回收純化后測序，并將測序結果在NCBI網站上用Blast進行核苷酸同源性比較，初步鑒定其種屬。

1.2.5 菌株對鎘的吸附試驗

研究所篩選菌株對鎘的吸附能力，通過與污染土中土著微生物的吸附能力比較，選出吸附效果最好的菌株。

選用土樣1做吸附試驗。在無菌條件下將所篩選菌株分別接種于牛肉膏液體培養基中，振蕩富集培養3 d，然后離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液多次洗滌，最后用無菌水配制成菌液。

取風干并過篩的土樣3 g于100mL三角瓶中，分別加入菌液30mL，并用無菌水作對照，讓其在28℃下放置（培養）。15 d后把土樣自然風干并研磨。

稱取0.1～0.3 g土樣，以HNO3為消解液，用微波消解儀進行消解處理，然后用電感耦合等離子光譜儀測定土樣中鎘的含量。對照空白，計算吸附率。吸附率（%）＝（C0－C）/C0×100%。

1.2.6 菌株對鉛的吸附試驗

在土壤的重金屬污染中，鎘和鉛常常伴隨存在，為此對分離出的耐鎘菌株進行對鉛的吸附能力研究。

原狀污染土樣1中鉛的含量為168 mg·kg-1。方法同對鎘的吸附試驗，計算吸附率。

1.2.7 pH和溫度對菌株生長的影響試驗

設定不同的pH和溫度對所篩選的耐鎘菌株進行培養，觀察對菌生長量的影響。設pH分別為3、5、7、9、11；溫度分別為 10、20、25、30、40℃。確定菌的最佳生長溫度和pH值，然后再進行培養，以培養時間為橫坐標，以OD600值為縱坐標，繪制菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、馴化及純培養

通過每次轉接前對菌液進行涂布發現:隨著鎘濃度的增加，菌落的數量明顯減少。Cd2+濃度為60 mg·L-1時，選擇合適的稀釋濃度10-7涂布的培養基平板，對生長較好的細菌進行分離純化，得到14株形態各異的耐鎘細菌，其中從車間土中篩選出13株，分別標記為Z1～Z13，工廠邊緣的土中篩選出1株，標記為B1。劃線純化的菌形態如圖1所示。

圖1 菌株在培養基上的菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strains on medium

2.2 菌株的鑒定

細菌的16S rDNA基因，在分子進化中非常保守，在一定程度上反映細菌的系統發生，因此，16S rDNA序列可用于微生物的鑒定及其分類地位的確定。以菌液為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度約為1500bp的擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物由北京三博遠志生物公司測序完成，得到的14株菌的基因序列在NCBI網站上用Blast進行同源比對，查詢結果如表2所示。

表2 在GenBank中比對所得最大相似度菌株Table2 Cultured bacteria and their most closely matched species in GenBank

根據比對結果，計算每種屬所占的比例，得出所采污染土樣中對鎘有較強耐性的各細菌種屬所占比例如圖3所示，其中72%為銅綠假單胞菌，可知銅綠假單胞菌對鎘有較強的耐受性，屬于優勢菌群。

圖2 土樣中微生物的組成Fig.2 Microbial community structure of soil sample

2.3 鎘和鉛的吸附試驗

測定土樣中鎘和鉛的含量，計算吸附率，結果如表3所示。

式中:C0-吸附前土樣中Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-）1；

C-吸附后土樣中 Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-1）。

由表3可知，與土樣中土著微生物相比，所篩選馴化出的14株菌對鎘和鉛都有一定的吸附效果，5、7、11、13號菌對鎘的吸附率比較高，都超過了40%，其Z13號菌對鎘的吸附率最高，達到47%，而Z11號菌對鉛的吸附率最高，也達到了47%。由于土壤中的重金屬污染，鎘和鉛常常伴隨存在，所以11和13號菌對鎘和鉛復合污染土壤的修復更具有實用價值。對這兩株進行生物學特性研究。

表3 菌株對鎘和鉛的吸附結果Table3 Results of adsorption of Cd2+and Pb2+by strains

2.4 pH和溫度對菌株生長的影響

2.4.1 溫度對菌株生長的影響

結果見圖3。

圖3 溫度對菌Z11和Z13生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of strain Z11 and Z13

如圖3所示，隨著培養溫度的升高，Z11和Z13生長量逐漸增大，在20～25℃下生長量達到最大值，繼續提高溫度，生長量逐漸下降，說明兩菌株都不能耐高溫。

2.4.2 pH對菌株生長的影響

結果見圖4。

圖4 pH對菌株Z11、Z13生長的影響Fig.4 Effect of pH on growth of strain Z11 and Z13

如圖4所示，Z11菌能夠在pH值為5～9范圍內生長，對外界酸堿性的變化具有較強的耐受性，最適生長pH為7～9；Z13菌最適生長pH為5～7，在堿性條件下幾乎不能生存，在偏酸環境下，生長良好。兩株菌在pH為7時生長都較好。

2.4.3 最佳生長條件下菌的生長曲線

在最佳生長溫度25℃，pH 7時培養菌，用722分光光度計比色法（波長為600nm）測定不同培養時間（3、6、9、12、18、24、30、38、48、60、72 h）細菌懸浮液的OD600值。生長曲線見圖5。

由圖5可知，菌株Z11在培養6 h后進入生長對數期，在30 h后進入穩定期，在38 h時達到生長最高峰，48 h后進入衰亡期；Z13是培養9 h后進入生長對數期，在30 h時達到生長高峰期，隨后進入穩定期，60 h后進入衰亡期，同一時刻測定的OD600值總體反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。

圖5 菌株Z11、Z13的生長曲線Fig.5 Growth curve of strains Z11 and Z13

3 討論

a.鎘不僅是微生物生長代謝過程中的必需元素，而且是毒性非常大的重金屬，微量的鎘都會對微生物產生毒害，但在受鎘污染的土壤中，微生物由于長期遭受重金屬的脅迫，具有了抵抗毒害的能力。為了進一步獲得對鎘有較高耐性的微生物，本試驗通過馴化培養，逐步提高重金屬離子的濃度，以提高微生物對重金屬的耐受性，經多代傳種而獲得目的菌株。最后從鎘含量超標的樣土中共篩選馴化出14株耐鎘的細菌。

b.通過與污染土中土著微生物的吸附能力比較，研究所篩選菌株對鎘的吸附能力。由結果可知與土樣中土著微生物相比，所篩選馴化出的14株菌對鎘都有一定的吸附效果，其中Z13號菌對鎘的吸附率最高，達到47%。

菌株最終要應用于土壤重金屬污染的治理，而在現實土壤的重金屬污染中，鎘和鉛常常伴隨存在，為此對分離出的耐鎘細菌進行對鉛的吸附能力研究。結果表明14株耐鎘細菌對鉛也有一定的吸附效果，其Z11號菌對鉛的吸附率最高，達到了47%。Z11和Z13菌對重金屬污染土壤的修復更具有實用價值。

從生物吸附角度看，細菌對金屬離子的吸附不僅與細胞活性、表面結構、組成及細胞的新陳代謝過程有關，還有多數研究認為細菌對鎘的耐性與質粒存在有關，有關耐鎘細菌細胞吸附鎘的機理還有待進一步論證。

c.通過吸附試驗研究，最終選定菌株Z11和Z13進行后續強化龍葵吸收重金屬鎘的試驗。所以本試驗只研究了這兩株菌的生長環境因素。結果表明兩株菌都不能耐高溫。由于土壤中溫度變化不大，所以對菌株的實際應用沒有影響。菌Z11對外界酸堿性的變化具有較強的耐受性，而菌Z13在偏酸的條件下生長較好。菌株對環境和土壤條件的適應性越強其應用價值越高。

4 結論

本試驗從鎘含量超標的樣土中共馴化出14株耐鎘的菌株。經過16S rDNA序列分析，初步鑒定出種屬，分析菌群結構，可知銅綠假單胞菌占72%，屬于優勢菌群。同時對耐鎘菌株分別進行鎘和鉛的吸附試驗研究，選取吸附鎘和鉛效果最好的兩株菌，菌Z11對鎘和鉛的吸附率分別達到40%和47%，菌Z13是47%和33%。對兩株菌進行生物學特性研究可知，它們在20～25℃下生長量達到最大值，都不能耐高溫。Z11最適生長pH為7～9，Z13菌最適生長pH值為5～7，Z11對外界酸堿性的變化具有較強的耐受性，Z13在偏酸的條件下生長較好。在最佳生長條件溫度為25℃，pH為7時繪制出兩株菌的生長曲線，同一時刻測定的OD600值總體反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。本研究為鎘污染土壤的微生物修復提供一定的試驗基礎和理論依據。

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