植物耐鹽基因工程研究進展

化 燁，才 華，柏 錫，李 勇，紀(jì) 巍，季佐軍，朱延明

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

全世界有超過800萬hm2的土地受到鹽害的影響，其數(shù)量占到世界總耕地面積的6%。由于過度開荒和灌溉，相當(dāng)大比例的農(nóng)業(yè)用地開始鹽漬化，預(yù)計在未來25年內(nèi)，將會有30%的耕地流失，到21世紀(jì)中期這個數(shù)字將會達到50%[1]。根據(jù)聯(lián)合國教科文組織和糧農(nóng)組織不完全統(tǒng)計，全世界鹽堿地的面積為9.5438億hm2，其中我國為9913萬hm2。我國堿土和堿化土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累積有關(guān)，因而堿化度普遍較高，嚴(yán)重的鹽堿土壤地區(qū)植物幾乎不能生存[2]。而通過傳統(tǒng)育種的方法來提高作物的耐鹽性能夠獲得的效果是非常有限的，這主要由于植物的耐鹽性在分子及生理水平上都是由復(fù)雜的機制來調(diào)控的[3]。在分子水平上，植物的耐鹽性通常具有多基因性狀的特點，而在生理水平上，鹽土植物和具低耐鹽性的植物也顯示出很大范圍的適應(yīng)性，這給傳統(tǒng)育種工作帶來很大的困難。基因工程技術(shù)通過改變一個或幾個基因的活性來提高植物的耐鹽性，它是在基因水平上提高植物耐鹽性，更具有精確性和穩(wěn)定性，提高了育種的高效性，極大地加快了育種速度，對于我們了解耐鹽植物復(fù)雜的性狀以及耐鹽機制也是非常必要的。隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的日趨成熟和迅猛發(fā)展，通過基因工程手段改良作物的耐鹽性已經(jīng)受到越來越廣泛的關(guān)注和重視。如何挖掘耐鹽基因和培育耐鹽優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物將是耐鹽分子育種的主要任務(wù)。本文就耐鹽相關(guān)基因的挖掘、各類耐鹽基因的應(yīng)用與植物耐鹽基因工程研究的現(xiàn)狀進行了分析，從而對植物耐鹽基因工程研究提供一定的參考價值和指導(dǎo)意義。

1 鹽脅迫信號傳導(dǎo)通路研究進展

當(dāng)鹽脅迫來臨時，植物細(xì)胞膜上的受體最先接受脅迫信號，然后將信號向下游傳導(dǎo)，產(chǎn)生第二信使，包括鈣離子、活性氧（ROS）和肌醇磷酸鹽（見圖1）[4]。這些第二信使，如肌醇磷酸鹽，進一步調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平。鈣結(jié)合蛋白，又稱為鈣離子傳感器，能感知胞漿內(nèi)鈣離子水平的改變。這些傳感器分別與各自下游的分子相互作用，激活蛋白磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)，最終引起功能蛋白表達或者由轉(zhuǎn)錄因子控制的特定種類基因的表達。這些基因的表達產(chǎn)物使植物能夠適應(yīng)不利的環(huán)境條件并正常生長。由此可見，植物單個細(xì)胞對于脅迫的響應(yīng)就像是一個完整的有機體一樣協(xié)調(diào)。脅迫誘導(dǎo)不僅使基因的表達發(fā)生了改變，還促進了一些植物激素（如脫落酸，水楊酸和乙烯）的產(chǎn)生。這些分子能夠擴大脅迫反應(yīng)最初的信號，并引起下一輪的信號傳導(dǎo)，這種信號傳導(dǎo)可能遵循與之前相同的路徑，或者是完全不同的信號傳導(dǎo)通路。輔助分子（例如修飾蛋白）可能沒有直接參與信號傳導(dǎo)過程，但它們卻參與了信號元件的修飾或組裝，并能夠附著在信號蛋白上與其協(xié)同作用。這些輔助分子包括豆蔻酰化酶、糖基化酶、甲基化酶和泛素化酶等。

目前已闡明與鹽脅迫信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的有促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，maPK）信號傳導(dǎo)途徑、鹽超敏感（Salt overly sensitive，SOS）信號傳導(dǎo)途徑以及其他蛋白激酶參與的信號傳導(dǎo)途徑[5]。在真核生物中存在maPK級聯(lián)途徑，其中包括3個功能上相互聯(lián)系的蛋白激酶，maPK被maPK激酶（maPKK）磷酸化而激活，maPKK又被maPK激酶激酶（maPKKK）磷酸化而激活。柏錫等將OsmaPK4基因整合到水稻基因中[6]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子在含0.2 mol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上能夠正常萌發(fā)；轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在0.4 mol·L-1NaCl處理時莖部仍然為綠色，種子萌發(fā)與幼苗生長情況略優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因植株。迄今已從多種植物中分離到了maPK基因，并發(fā)現(xiàn)maPK級聯(lián)途徑與植物對干旱、高鹽、低溫、激素（乙烯、脫落酸、赤霉素、生長素）、創(chuàng)傷、病原反應(yīng)、氧化反應(yīng)以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)[7]，但各途徑之間的相互關(guān)系還需進一步研究。Zhu等通過突變和耐鹽篩選[8]，從擬南芥中篩選到一系列SOS突變株，發(fā)現(xiàn)了一個全新的植物鹽脅迫信號傳導(dǎo)途徑。這些SOS突變體分屬5個等位基因群，即 SOS1～SOS5，其中 SOS1、SOS2和SOS3在同一信號傳導(dǎo)途徑中起作用[9]，SOS2的活化和SOS2與SOS3的相互作用都需要Ca2+的參與[10-11]，SOS3-SOS2除了直接對SOS1進行磷酸化[12]，還能夠調(diào)節(jié)SOS1的表達，隨后的研究還發(fā)現(xiàn)SOS3-SOS2還可能調(diào)節(jié)其他鹽脅迫效應(yīng)器的表達[13]。蛋白激酶在胞內(nèi)調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中也扮演了重要角色，它是位于細(xì)胞膜上的受體蛋白激酶，不僅能夠感受外界脅迫信號，還參與胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)。依據(jù)磷酸化氨基酸的種類可將蛋白激酶分為3類，即酪氨酸蛋白激酶、組氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，maPK即為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。除maPK外，其他類型的蛋白激酶也參與了鹽脅迫的信號傳導(dǎo)，主要包括鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶（Calcium-dependentand calmodulin-independent protein kinase，CDPK）、受體蛋白激酶、GSK3/shaggy激酶和組氨酸激酶等。除上述幾種蛋白激酶外，還有其他蛋白激酶如核糖體蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白激酶等。

在鹽脅迫信號傳導(dǎo)通路中涉及到生理代謝、細(xì)胞防御、能量產(chǎn)生和運輸、離子轉(zhuǎn)運和平衡、細(xì)胞生長和分裂等諸多方面的相關(guān)的基因,還有很大一部分至今未知其功能。這些基因以某種協(xié)調(diào)的機制發(fā)揮作用，維持鹽脅迫下植物正常的生長發(fā)育。

2 植物耐鹽相關(guān)基因的研究

植物受到非生物脅迫時，很多基因和它們的表達產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對此做出響應(yīng)。了解這些響應(yīng)脅迫基因的功能，將有助于闡明植物脅迫耐受機制，從而更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定地將這些基因應(yīng)用于耐鹽基因工程中。

2.1 植物耐鹽相關(guān)基因的挖掘

2.1.1 基于EST數(shù)據(jù)庫的基因挖掘

通過構(gòu)建脅迫處理各種作物的cDNA文庫，獲得了大量的表達序列標(biāo)簽（ESTs），從而識別非生物脅迫相關(guān)基因[14]。在植物生長發(fā)育的不同階段，脅迫處理提取作物不同部位組織的mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，并對其進行測序來豐富EST數(shù)據(jù)庫。通過對EST數(shù)據(jù)庫的不斷完善，已將水稻和擬南芥基因組序列信息補充完整，為基因挖掘提供了寶貴的資源。對cDNA文庫中EST序列進行拼接，更為我們提供了關(guān)于脅迫反應(yīng)中相關(guān)基因的數(shù)量、基因組成和可能的基因家族數(shù)量等相關(guān)信息。同時，脅迫響應(yīng)基因通過BLASTX與Swissprot數(shù)據(jù)庫進行比對，對它們進行注釋，可以將不同物種中脅迫響應(yīng)的基因聯(lián)系起來。這樣，拼接過程中的一致序列提供了比單個EST數(shù)據(jù)更清晰的數(shù)據(jù)組。研究表明，在所有脅迫處理的cDNA文庫中，未知基因仍然占有非常高的比例（20%～30%）。注釋這些未知功能的基因，能夠繪制出一個更完整的植物脅迫應(yīng)答機制的輪廓。Wang等通過建立鹽脅迫條件下鹽芥的cDNA文庫[15]，發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫下超量表達的ESTs。Sreenivasulu等在單子葉植物，例如大麥、小麥、玉米和水稻中也進行了類似的工作，發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫相關(guān)的ESTs，并對耐鹽相關(guān)基因進行挖掘[16]。同時，在挖掘這些基因的過程中，我們也會得到關(guān)于植物脅迫耐受基本調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)的啟示。

2.1.2 通過轉(zhuǎn)錄譜確定脅迫響應(yīng)的基因

對比基于ESTs的基因組學(xué)方法，SAGE、MPSS、基因芯片技術(shù)和實時定量PCR（qRT-PCR）能夠定量分析脅迫處理植物的各個發(fā)育階段不同組織中高通量表達的基因，而想要了解基因表達的類型和功能可以通過基于EST的cDNA芯片來實現(xiàn)。基因表達譜利用cDNA芯片可以鑒定更多與脅迫耐受機制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和傳導(dǎo)通路。通過對基因轉(zhuǎn)錄水平的研究，來鑒定更多脅迫響應(yīng)的基因。在不同物種甚至同一物種不同的基因型中，基因?qū)τ诿{迫的響應(yīng)也是不同的，因為某些基因型具有高效的信號感知能力并且在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變，使它們對脅迫環(huán)境具有適應(yīng)性和完全的耐受性。當(dāng)然，不同的脅迫類型和脅迫程度，基因的表達也是不相同的。Kawasaki等報道了在高鹽條件下，水稻鹽耐受型品種Pokkali和鹽敏感型品種IR29在脅迫15 min后到第7天的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)鹽耐受的栽培品種在轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)在鹽脅迫15 min以后就發(fā)生了，并且表現(xiàn)出許多基因的上調(diào)表達，包括甘氨酸豐富蛋白、ABA和脅迫誘導(dǎo)蛋白、金屬硫樣蛋白、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過氧化物酶、水通道蛋白亞基、枯草桿菌蛋白酶抑制劑和酪氨酸酶抑制劑等等[17]。他們還發(fā)現(xiàn)在鹽處理過程中，許多耐鹽品種中上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的響應(yīng)速度比在鹽敏感的栽培品種中要慢。同樣，Sreenivasulu等觀察鹽耐受型與敏感型谷子的幼苗在250 mmol·L-1NaCl脅迫下基因表達類型，發(fā)現(xiàn)14個特定的ESTs在鹽耐受型的谷子株系中上調(diào)表達，并且延長鹽脅迫時間，仍然得到相同的結(jié)果[18]，這與Kawasaki等在水稻中得到的結(jié)果是一致的[17]。據(jù)此，學(xué)者們認(rèn)為，在長時期的非生物脅迫處理過程中的谷類植物，它的蛋白酶抑制劑、應(yīng)激蛋白、水通道和抗氧化劑成分是能夠被誘導(dǎo)的，并推測這些成分在植物抵抗不同非生物脅迫處理的過程中起著重要的作用。此外，目前應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個重要方面就是根據(jù)多種脅迫相互作用下基因表達的類型來確定脅迫響應(yīng)過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子。基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析已經(jīng)確定了成百上千的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，這些轉(zhuǎn)錄因子是由許多環(huán)境脅迫誘導(dǎo)得到的或者響應(yīng)這些脅迫信號的[19]。轉(zhuǎn)錄因子的表達類型是高度復(fù)雜的，因此植物對于非生物脅迫的耐受力和抵抗力是由一個非常復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制的。通過研究在非生物脅迫來臨時轉(zhuǎn)基因植物或者敲除突變體在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，能夠確定基因間相互作用及其下游元件。Seki等在擬南芥超表達DREB1a基因的轉(zhuǎn)錄譜（1300個基因）中，確定有12個冷和干旱誘導(dǎo)的基因是DERB1轉(zhuǎn)錄因子家族的靶基因[19]。

2.1.3 應(yīng)用高通量基因失活技術(shù)確定基因在非生物脅迫中潛在的功能

盡管目前應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)來挖掘基因還在繼續(xù)進行，但鑒定非生物脅迫響應(yīng)候選基因的任務(wù)量還是很大，并且超過40%～50%的已知基因的功能仍然不確定。為了揭示他們在非生物脅迫耐受中可能的功能，也可以通過基因失活的高通量方法或突變體篩選來確定并闡釋基因的功能。目前有兩個主要的互補方法來確定目的基因的突變體，分別為TILING和T-DNA插入。這兩種方法已用來挖掘擬南芥、水稻、玉米和大麥中非生物脅迫響應(yīng)基因的潛在功能。Zhu等通過常規(guī)遺傳篩選，獲得了擬南芥sos突變體，該突變體顯示出對于NaCl脅迫的高度敏感，并且生長受到了抑制[20]。他們還發(fā)現(xiàn)sos突變體在缺K+培養(yǎng)基中生長會受到影響，并且對Na+和Li+離子也高度敏感。Shi等根據(jù)最近的生理生化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)sos1在獲得K+的過程中并不直接起作用[21]。通過鑒定，認(rèn)為sos1是Na+/H+反向轉(zhuǎn)運體，通過將Na+離子泵入液泡來維持細(xì)胞質(zhì)中低濃度的Na+。

2.2 植物耐鹽相關(guān)基因類別與應(yīng)用

2.2.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因

許多植物在失水脅迫條件下會積累小分子相容性溶質(zhì)或滲壓劑。導(dǎo)入滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因，使植物在水分脅迫下能合成更多的代謝產(chǎn)物（如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、甘露醇、果聚糖、甘氨酸等），有利于提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強植物的耐鹽性。Garg等在水稻中超量表達細(xì)菌海藻糖合成基因，增加了水稻對鹽的耐受性[22]:在100 mmol·L-1NaCl中培養(yǎng)4周，轉(zhuǎn)基因植株的干重是未轉(zhuǎn)基因植物干重的4倍。Abebe等在小麥中超量表達細(xì)菌甘露醇合成基因mt1D，能夠增加小麥的耐鹽性:在150 mmol·L-1NaCl中，缺失mt1D基因的植株芽鮮重減少了70%，而轉(zhuǎn)基因植物只減少了50%[23]。Waditee等發(fā)現(xiàn)從甘氨酸到甜菜堿的生物合成途徑，該途徑由兩個N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化[24]。N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因在甜菜堿合成過程中的潛在作用在淡水藍(lán)藻和擬南芥中得到證實。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻中共同表達N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因會使甜菜堿在植物體內(nèi)大量積累，并賦予淡水藍(lán)藻耐鹽性，使它能夠在海水中正常生長。

2.2.2 氧脅迫相關(guān)基因

鹽堿、干旱和低溫脅迫同時伴隨有活性氧（ROS）的產(chǎn)生。這些毒性分子破壞生物膜，尤其是破壞線粒體和葉綠體的膜系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化脅迫。通過導(dǎo)入解毒酶和氧化脅迫相關(guān)酶的基因，如SOD、CAT和GST等，并使其過量表達，以有效地排除活性氧自由基，保護和穩(wěn)定蛋白復(fù)合體和膜結(jié)構(gòu)，從而提高細(xì)胞耐脫水的能力。Yoshimura等通過不同的抗氧化劑和ROS清除劑來減輕氧化損傷，增強植物對于鹽和干旱的耐受性[25]。在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中超量表達衣藻的谷胱甘肽過氧化物酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯顯示出對氧化脅迫的耐受性，這種氧化脅迫多是由寒冷和鹽脅迫造成的。Sunkar等在擬南芥中超量表達醛脫氫酶AtALDH3基因，通過消除細(xì)胞內(nèi)的ROS，提高了擬南芥對于干旱和鹽的耐受性[26]。

2.2.3 離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因

Na+是鹽漬土壤中主要的有害離子，在植物體中過量積累會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、降低胞質(zhì)酶活性、阻礙光合作用和代謝過程，引發(fā)離子脅迫。研究表明，在高鹽環(huán)境下，Na+進入液泡主要依賴液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白以及液泡型H+-ATPase和H+-PPase基因表達的上調(diào)或活性的提高[27]。而胞質(zhì)內(nèi)過多的Na+排出胞外主要由質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白，利用質(zhì)膜型H+-ATPase和H+-PPase產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度完成。Gaxiola等首先在擬南芥中克隆了編碼液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白AtNHX1基因[28]，Xue等利用該基因在小麥中超量表達，使轉(zhuǎn)基因小麥在中度鹽漬土中的產(chǎn)量提高15%[29]。

2.2.4 編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因

轉(zhuǎn)錄因子在植物滲透脅迫反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用，它們在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達會激活許多抗逆功能基因同時表達，獲得比單獨導(dǎo)入某個功能基因更強的抗逆性。脅迫響應(yīng)基因的啟動子有幾個典型的順式作用元件，例如DRE/CRT、ABRE和MYCRS/MYBRS，它們受到各種上游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在了解順式作用元件的基礎(chǔ)上，借助酵母單雜交的手段即可分離到與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因。現(xiàn)已有很多與DRE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子被分離出來，分別命名為 CBF1/DREB1B、CBF2/DREB/C和CBF3/DREB1A。研究表明，CBF類轉(zhuǎn)錄因子受低溫誘導(dǎo)，可以提高植物對低溫的抗性。而與其同源的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子則受高鹽、干旱調(diào)節(jié)，參與植物耐鹽的信號傳導(dǎo)過程。Park等將轉(zhuǎn)錄因子MsPRP2、SCOF-1、Tsi1基因?qū)胲俎！煵莸龋部商岣咿D(zhuǎn)基因植株對滲透脅迫的抗性[30]。

2.2.5 感應(yīng)和傳導(dǎo)脅迫信號的蛋白激酶基因

蛋白激酶是一類胞內(nèi)信使依賴的、在蛋白質(zhì)磷酸化過程中起中介和放大作用，是信號傳遞中關(guān)鍵酶，它廣泛參與植物對干旱、鹽脅迫、ABA誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)。Shou等在玉米中組成表達maPKKK/NPK1能夠激活氧化信號級聯(lián)系統(tǒng)，使轉(zhuǎn)基因植物對低溫、高溫和鹽具有耐受性[31]。Liu等發(fā)現(xiàn)了一種新的鈣傳感器CBL（鈣調(diào)磷酸酶B細(xì)胞樣）蛋白[32]。不同的CBL同工型在脅迫條件下都是上調(diào)的。并且CBLs特定的與一類稱為CBL互作蛋白激酶（CIPKs）相互作用，通過磷酸化作用將信號傳導(dǎo)給下游的信號元件。本研究室在野生大豆耐鹽cDNA文庫中篩選到CRCK基因，該基因的產(chǎn)物在Ca2+存在下能夠與CaM結(jié)合，參與滲透脅迫信號傳導(dǎo)過程。超量表達CRCK基因的擬南芥對高鹽和ABA具有明顯的抗性。現(xiàn)已將該基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆，并對抗性植株進行分子生物學(xué)檢測及生物學(xué)檢測，最終獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆新品系。

2.2.6 解旋酶基因

非生物脅迫往往影響的是細(xì)胞基因表達機制，參與處理核酸的解旋酶也可能受到影響。大部分DNA解旋酶存在于細(xì)胞，并參與不同發(fā)展階段基因的調(diào)控以及脅迫條件下的基因調(diào)控。這些DNA解旋酶可能有不同的底物以及構(gòu)造的要求。雖然已經(jīng)許多文獻報道了大腸桿菌、噬菌體、病毒、酵母菌、小牛胸腺和人類的DNA解旋酶，但只有少數(shù)DNA解旋酶的生物學(xué)作用被揭示[33]。此外，我們關(guān)于植物DNA解旋酶的知識也很有限，只知道有6個被純化的解旋酶蛋白。解旋酶的作用及分子機制現(xiàn)在才剛剛開始探索。目前，正在研究PDH45（豌豆的DNA解旋酶45）在鹽脅迫耐受中的潛在作用[34]。已經(jīng)證明，超量表達PDH45的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出較高的耐鹽性。在連續(xù)的鹽脅迫下，T1代轉(zhuǎn)基因植株能夠成長并產(chǎn)生正常的可育種子，根據(jù)種子的重量推算產(chǎn)量并沒有任何削減[35]。最近，一個新的DNA解旋酶基因PDH47（豌豆的DNA解旋酶47）也已經(jīng)被分離，并證明是受冷誘導(dǎo)表達的[36]。

2.2.7 其他調(diào)控序列

近年來研究發(fā)現(xiàn)一些小的非編碼RNA，MicroRNAs（miRNA）和 siRNAs，它們是 mRNA 降解、轉(zhuǎn)譯抑制和染色質(zhì)修飾的重要調(diào)控子。miRNA作用的靶基因包括代謝途徑中的酶類基因、泛蛋白化途徑中的酶基因、轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)組分和涉及RNA加工、蛋白質(zhì)合成方面的基因。Sunkar等在已知的43個miRNA中鑒定發(fā)現(xiàn)4個miRNA在不同的非生物脅迫條件下表達發(fā)生變化[37]。由此可見，miRNA在植物對環(huán)境脅迫的應(yīng)答中可能起重要的調(diào)控作用。同時，發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)源小RNAs也可能在植物對環(huán)境脅迫的應(yīng)答方面起著重要的作用。

3 展望

非生物脅迫特別是鹽脅迫，是世界范圍內(nèi)影響糧食產(chǎn)量的重要因素。應(yīng)用植物生物技術(shù)包括分子輔助育種和基因工程手段提高作物的耐鹽性是快速并且有效的方法。不同研究者從諸多方面對植物的耐鹽機制作了大量研究，并已達到一定的廣度和深度，但由于植物鹽脅迫響應(yīng)過程是一個多基因表達的結(jié)果，因此對任何一個基因進行操縱都可能導(dǎo)致大量相關(guān)基因和他們的產(chǎn)物發(fā)生改變。而在提高植物耐鹽性的研究中，要盡可能的減少這些改變，不破壞植物的天然機制，適時的激活脅迫基因的表達。啟動子和轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動、激活脅迫基因時，應(yīng)在沒有脅迫條件下盡量降低外源基因的表達量，基因的產(chǎn)物也應(yīng)該針對適合的組織和細(xì)胞定位，控制表達的時間和豐度，從而不影響植物的生長發(fā)育，保證作物的產(chǎn)量。因此，在后續(xù)植物對鹽脅迫耐受性的研究中，應(yīng)該考慮到:①選用安全性較高的篩選標(biāo)記基因；②鹽、干旱、高溫這幾種脅迫耐受的機制是相互干擾的；③植物受到脅迫和從脅迫中恢復(fù)的周期是一個普遍的過程，也是與脅迫耐受密切相關(guān)的；④應(yīng)觀察長期脅迫對植物生長的影響，因為這種長期脅迫才更接近大多數(shù)作物的壽命。因此，對于作物實際耐受性的結(jié)論，必須包括生物量、產(chǎn)量和存活率等數(shù)據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的不斷發(fā)展和完善，植物耐鹽生理和機理研究的不斷深入以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)將生物技術(shù)與傳統(tǒng)的生物學(xué)和育種學(xué)充分的整合起來，在植物體內(nèi)建立可受鹽脅迫誘導(dǎo)表達的、比較完善的耐鹽體系，為提高植物耐鹽性探索出更可靠、更穩(wěn)定的新途徑，以更好地提高植物尤其是糧食作物的耐鹽性。

[1]FAO,FAO Land and Plant Nutrition management Service,Inc.Global network on integrated soil management for sustainable use of salt-affected soils[EB/OL].[2010-03-08].http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush.

[2]Wang W,Vinocur B,Altman A.Plant responses to drought,salinity and extreme temperatures:towards genetic engineering for stress tolerance[J].Planta,2003,218(1):1-14.

[3]Flowers T J.Improving crop salt tolerance[J].Journal of Experimental Botany,2004,55(396):307-319.

[4]mahajan S,Tuteja N.Cold,salinity and drought stresses:an overview[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2005,444:139-158.

[5]秘彩莉,郭光艷,齊志廣,等.植物鹽脅迫的信號傳導(dǎo)途徑[J].河北師范大學(xué)學(xué)報,2007,31(3):375-380.

[6]柏錫,朱延明,李麗文,等.轉(zhuǎn)OsmaPK4基因水稻耐鹽性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(8):53-57.

[7]Romeis T,Piedras P,Zhang S.Rapid Avr92 and Cf92 dependent activation of maP kinases in tobacco cell cultures and leaves:convergence of resistance gene,elicitor,wound and salicylate responses[J].Plant Cell,1999,11(2):273-287.

[8]Liu J,Zhu J K.An Arabidopsis mutant that requires increased calcium for potassium nutrition and salt tolerance[J].Proc Natl Acad Sci,1997,94(26):14960-14964.

[9]Hasegawa M,Bressan R,Pardo J M.The dawn of plant salt tolerance genetics[J].Trends Plant Sci,2000,5(8):317-319.

[10]Liu J,Ishitani M,Hal Fter U,et al.The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance[J].Proc Natl Acad Sci,2000,97(7):3730-3734.

[11]Hal Fter U,Ishitani M,Zhu J K.The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calciumbinding protein SOS3[J].Proc Natl Acad Sci,2000,97(7):3735-3740.

[12]Quintero F J,Ohta M,Shi H,et al.Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+homeostasis[J].Proc Natl Acad Sci,2002,99(13):9061-9066.

[13]Uozumi N,Kim E J,Uubio F,et al.The Arabidopsis HKT1 gene homolog mediates inward Na+currents in Xenopus laevis oocytes and Na+uptake in Saccharomyces cerevisiae[J].Plant Physiol,2000,122(4):1249-1259.

[14]Sreenivasulu N,Sopory S K,Kavi Kishor P B.Deciphering the regulatory mechanisms of abiotic stress tolerance in plants by genomic approaches[J].Gene,2007,388(1):1-13.

[15]Wang H,Huang Z,Chen Q,et al.Ectopic overexpression of tomato JERF3 in tobacco activates downstream gene expression and enhances salt tolerance[J].Plant Molecular Biology,2004,55(2):183-192.

[16]Sreenivasulu N,Varshney R K,Kishor K,et al.Tolerance to abiotic stress in cereals:a functional genomics approach[M]//Gupta P K,Varshney R K.[s.i.]:Cereal Genomic,2004:483-514.

[17]Kawasaki S,Borchert C,Deyholos M,et al.Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice[J].Plant Cell,2001,13:889-905.

[18]Sreenivasulu N,Miranda M,Prakash H S,et al.Transcriptome changes in foxtail millet genotypes at high salinity:identification and characterization of a PHGPX gene specifically upregulated by NaCl in a salt-tolerant line[J].J Plant Physiol,2004b,161:467-477.

[19]Seki M,Narusaka M,Abe H,et al.Monitoring the expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and cold stresses by using a full-length cDNA microarray[J].Plant Cell,2001,13:61-72.

[20]Zhu J K.Cell signaling under salt,water and cold stresses[J].Plant Biol,2001(4):401-406.

[21]Shi H Z,Ishitani M,Kim C S,et al.The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+antiporter[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:6896-6901.

[22]Garg A K,Kim J K,Owens T G,et al.Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99(25):15898-15903.

[23]Abebe T,Guenzi A C,martin B,et al.Tolerance of mannitol accumulating transgenic wheat to water stress and salinity[J].Plant Physiology,2003,131(4):1748-1755.

[24]Waditee R,Bhuiyan M N H,Rai V,et al.Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abioticstress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2005,102(5):1318-1323.

[25]Yoshimura K,Miyao K,Gaber A,et al.Enhancement of stress tolerance in transgenic tobacco plants overexpressing Chlamydomonas glutathione peroxidase in chloroplasts or cytosol[J].Plant J,2004,37:21-33.

[26]Sunkar R,Bartels D,Kirch H H.Overexpression of a stressinducible aldehyde dehydrogenase gene from Arabidopsis thaliana in transgenic plants improves stress tolerance[J].The Plant Journal,2003,35(4):452-464.

[27]Golldack D,Dietz K J.Salt-induced expression of the vacuolar H+-ATPase in the common ice plant is developmentally controlled and tissue specific[J].Plant Physiology,2001,125(4):1643-1654.

[28]Gaxiola R A,Rao R,Sherman A,et al.The Arabidopsis thaliana proton t ransporters,AtNhx1 and Avp1 can function in cation detoxification in yeast[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:1480-1485.

[29]Xue Z Y,Zhi D Y,Xue G P,et al.Ehanced salt tolerance of transgenic wheat(Tritivumae stivnm L.)expressing a vacuolar Na+/H+antiporter gene with improved grain yields in saline soics in the field and reduced level of leaf Na+[J].Plant Science,2004,167(4):859-899.

[30]Park J M,Park C J,Lee S B,et al.Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco[J].The Plant Cell Online,2001,13(5):1035-1046.

[31]Shou H,Bordallo P,Fan J B,et al.Expression of an active tobacco mitogen-activated protein kinase kinase kinase enhances freezing tolerance in transgenicmaize[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2004,101(9):3298-3303.

[32]Liu J,Zhu J K.A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance[J].Science,1998,280(5371):1943.

[33]Lohman T M,Bjornson K P.Mechanisms of helicase-catalyzed DNA unwinding[J].Annual Review of Biochemistry,1996,65(1):169-214.

[34]Tuteja N,Tuteja R,Prokaryotic and eukaryotic DNA helicases.Essential molecular motor proteins for cellularmachinery[J].Biochem,2004,271:1835-1848.

[35]Pham X H,Reddy M K,Ehtesham N Z,et al.A DNA helicase from Pisum sativum is homologous to translation initiation factor and stimulates topoisomerase I activity[J].Plant J,2000,24:219-229.

[36]Vashisht A A,Pradhan A,Tuteja R,et al.Cold-and salinity stressinduced bipolar pea DNA helicase47 is involved in protein synthesis and stimulated by phosphorylation with protein kinase C[J].Plant Journal,2005,44(1):76.

[37]Sunkar R,Zhu J K.Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis[J].The Plant Cell Online,2004,16(8):2001-2019.