豬IP-10蛋白真核表達載體的構建

趙 協 張廷虹 常維山 （山東農業大學動物科技學院 泰安 271018）

豬IP-10蛋白真核表達載體的構建

趙 協 張廷虹 常維山*（山東農業大學動物科技學院 泰安 271018）

根據GenBank上發表的豬IP-10蛋白的核苷酸序列設計并合成1對特異性引物，采用RT-PCR方法擴增出目的片段，將擴增產物連接到表達載體pcDNA3.1上，進行序列測定和分析。結果表明，所克隆的目的基因的核苷酸長為312bp，共編碼104個氨基酸。該基因片段與已發表的豬IP-10蛋白基因核苷酸序列同源性為100%，氨基酸同源性為100%。本試驗為重組豬IP-10蛋白的生產及功能研究奠定了基礎。

豬IP-10蛋白 重組質粒 表達

*通訊作者

干擾素誘導蛋白10(Interferon-inducible protein 10，IP-10)，又名CXC趨化因子配體10(CXCL10)，屬趨化因子CXC類ELR-(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸)亞族，其特異性受體為CXCR3。IP-10主要由Ⅰ型、Ⅱ型干擾素以及脂多糖(LPS)等刺激成纖維細胞、角蛋白細胞、單核/巨噬細胞、內皮細胞、T細胞等30多種細胞分泌[1,2]。研究表明，IP-10具有招募中性粒細胞、促進多種細胞因子分泌、抑制部分腫瘤生長等多種生物學作用，特別是能作為趨化因子介導Th1型炎癥反應而參與多種疾病的發生，因此在抗感染免疫、治療自身免疫性疾病等方面具有廣泛的應用前景[3,4]。而且血清中IP-10的水平與乙肝、系統性紅斑狼瘡、病毒性心肌炎等疾病有相關關系。為此應用RT-PCR技術從豬脾臟中擴增了編碼IP-10的基因片段，并將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1中，以進一步探討其生物學活性及其在疾病治療中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒載體和細胞株 表達載體pcDNA3.1、大腸桿菌DH5α和BL21，均由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 限制性內切酶BamH I和EcoR I、Taq DNA聚合酶、反轉錄酶AMV、DNA片段純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4連接酶，均購自Ta KaRa公司。其他試劑為進口或國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank上發表的豬IP-10基因序列和相關文獻報道設計一對引物，兩端分別加酶切位點BamHⅠ和EcoR I，由上海生工生物工程有限公司合成.上游引物：CGGGATCCATGAACCAAAGTGCT，下游引物：GGAATTCCTTATGCTTCTCTCTGTGTT(無終止密碼子)。

1.2.2 總RNA的提取和RT-PCR 使用Trizol試劑采用一步法從豬脾臟中提取總RNA[5]，并且使用特異性引物合成cDNA，采用RT-PCR方法擴增目的基因，反應條件為：95℃預變性7min，94℃30s，55℃30s，72℃40s 共30個循環，最后72℃延伸10min。

1.2.3 重組質粒的構建 IP-10基因的PCR產物經PCR產物純化試劑盒純化后，和表達載體pcDNA3.1用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，純化回收載體pcDNA3.1與目的基因片段IP-10，然后按一定的比例在T4連接酶作用下，16℃連接反應過夜后，轉化感受態大腸桿菌BL21，涂布于含氨芐青霉素LB固體培養基，37℃培養。挑取單克隆菌落擴增培養，提取重組pCDN3.1-IP-1質粒以備作鑒定。

1.2.4 重組質粒鑒定和測序 用上一步提取的重組質粒做模板進行PCR擴增鑒定以及用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定。將經鑒定為陽性克隆的重組質粒純化后，送上海生物工程公司進行DNA序列測定，測序結果在www.ncbi.nlm.nih.gov網站中的GenBank中進行比對。

2 結果分析

2.1 豬IP-10 mRNA的RT-PCR擴增結果

取5μl PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后，發現有1個300bp左右的條帶，與預期的條帶大小一致(圖1) 。

2.2 重組質粒pCDN3.1-IP-10的雙酶切鑒定結果

重組質粒pCDN3.1-IP-10經BamH I和EcoR I酶切，可切出5500bp和300bp大小條帶，與預期大小一致(圖2)。

2.3 豬IP-10基因序列比對

豬IP-10基因的序列測定及分析鑒定為陽性的菌株經大連寶生物公司雙向測序后，得到豬IP-10基因序列(圖3)。該基因全長312bp，編碼104個氨基酸。將其與已發表豬IP-10基因序列相比，同源性為100%。

圖1：M：DL8000 DNA marker1：IP-10pcr產物 2：positive control

圖2：M：DL8000 DNA marker 1：pCDN3.1載體和IP-10片段

圖3 Query為克隆到的豬IP-10基因，Sbjct為其它發表的序列

3 討論

IP-10是1985年由Luster等用γ干擾素(interferonγ，IFN-γ)刺激淋巴細胞U937后用雜交的方法從cDNA文庫中篩選出來的[6]，后來又在小鼠中發現了與IP-10同源性很高的基因，命名為C7/CRG。其N末端含有4個保守的半胱氨酸(Cys)殘基，前兩個半胱氨酸中被1個任意氨基酸分隔，是受體活化的重要區域。IP-10與血小板因子-4(platelet factor-4，PF-4)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)具有30%同源性，故可首先預測它在炎癥反應中發揮作用。研究表明，IP-10可趨化多種炎性細胞，包括T淋巴細胞、單核細胞和自然殺傷(NK) 細胞等，而且它在效應T細胞的產生，抗腫瘤，抑制血管新生等方面也具有較強的生物活性，因此，對IP-10結構、功能及其生物活性的研究具有重要意義。

豬IP-10是一個包含104個氨基酸的分泌蛋白，前21個氨基酸構成信號肽，總分子量約為11kD。Yang克隆了編碼豬IP-10的cDNA序列，發現它與人類、小鼠、山羊等哺乳動物的IP-10蛋白具有較高的相似性，其核心活性區域具有高度保守性[7]。Liu從不同品種豬的背長肌組織中克隆出IP-10基因并分析了其不同性[8]。本試驗旨在研究豬重組IP- 10蛋白的活性和趨化功能，目前已經成功擴增出了豬IP-10基因，并構建了豬IP-10蛋白重組真核表達質粒，為進一步研究其生物學活性及其應用奠定了基礎。

[1]Dufour JH, Dziejman M, Liu MT, et al. IFN-gamma-inducible protein10(IP-10; CXCL10) def-icient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking[J]. Immunology, 2002, 168(7): 3195-3204.

[2]Tamaru M, Tominaga Y, Yatsunami K, et al.Cloning of the murine interferon- inducible protein 10(IP-10)receptor and its specific expression in lymphoid organs[J].Bioch &Biop Res Commu, 1998, 251(1) :41 - 48.

[3]Luster A D. IP - 10, a C-X-C Chemokine, Elicits a Potent Thymus -dependent Antitumor Response In Vivo[J]. ExpMed, 1993, 178(3): 1057-1065.

[4]喻三紅, 熊思東. 干擾素誘導蛋白-10介導的Th1 型炎癥反應[J]. 生命的化學, 2001, 22 (5): 432-435.

[5]鄭曉飛. RNA實驗技術手冊[M]. 北京:科學出版社, 2004: 24-26.

[6]Luster A D. Gamma-interferon transcriptionally regulates an earlyresponse gene containing homology toplateletproteins.Nature[J], 1985, 315(6021): 672-676.

[7]Yang J, Choi I, Kim SD. Molecular characterization of cDNA encoding porcine IP-10 and induction of porcine endothelial IP-10 in response to human TNF-alpha[J]. Vet Immunol Immunopathol. 2007, 15; 117(1-2): 124-8.

[8]Liu, G. Y.;Xiong, Y. Z. Isolation, sequence analysis and expression profile of a novel porcine gene, CXCL10, differentially expressed in the Longissimus dorsi muscle tissues from Meishan, Meishan × Large White cross and Large White pigs[J]. DNA Sequence. 2007, Vol. 18(6): 415-422.

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