大果沙棘品種間雜交F1代的RAPD分析

于澤源，劉雨娜，李興國(guó)，單金友

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150070；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所，黑龍江 綏棱 152204）

RAPD作為一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，自誕生以來(lái)就受到廣泛的重視和應(yīng)用，是進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、物種親緣關(guān)系鑒定、輔助育種等方面研究的有效手段[1]，逐漸被人們應(yīng)用于植物遺傳和育種的各個(gè)領(lǐng)域[2－3]。通常利用RAPD技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜需要有親本單交產(chǎn)生的F2群體、回交群體（Backcross Population）、重組自交系（Recombinant Inbred Lines）、雙單倍體群體（Double Haploid）等，這對(duì)多年生果樹來(lái)說(shuō)并不容易[4]，在傳統(tǒng)果樹雜交育種理論的基礎(chǔ)上，提出“雙假測(cè)交戰(zhàn)略”（Double Pseudo-testcross Strategy），利用多年生果樹遺傳上高度雜合的特點(diǎn)，雜交后代就相當(dāng)于F1自交，產(chǎn)生F2代群體，即以F1代為作圖群體，使多年生果樹遺傳作圖的難題迎刃而解。而利用F1群體構(gòu)建RAPD遺傳連鎖圖譜，必須首先了解RAPD在F1代的分離情況。本研究對(duì)大果沙棘品種間雜交F1代進(jìn)行了RAPD分析，以期為開展沙棘分子遺傳育種及連鎖圖譜的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所。供試材料為7個(gè)大果沙棘雜交組合及184株后代株系（見表1）。

表1 雜交組合及株系數(shù)Table 1 Number of plant and hybridization combinations

材料楚伊，果實(shí)圓柱形、橘黃色、果柄長(zhǎng)度36 mm、百粒重65.17 g，枝條無(wú)刺或少刺；HS-20、HS-21、HS-22均為從蒙古沙棘烏蘭格木實(shí)生后代中選出的優(yōu)系，果實(shí)橢圓形～近圓形、橙紅色～橙色、果柄長(zhǎng)度31～40 mm、百粒重48～88.25 g，枝條少刺或無(wú)刺；阿列伊為雄株授粉品種，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、枝條無(wú)刺；蒙優(yōu)1、蒙優(yōu)2、蒙優(yōu)3、蒙優(yōu)4均為從蒙古沙棘烏蘭格木實(shí)生后代中選出優(yōu)良的授粉雄株，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、枝條少刺或無(wú)刺。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

PE-9600型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Perlin Elmer公司）、BEACKMAN DU-7紫外分光光度儀（德國(guó)）、DYY-III型水平式電泳槽（北京）等。

試驗(yàn)所用引物購(gòu)自上海生物工程公司，Taq酶、dNTP、Buffer緩沖液、瓊脂糖購(gòu)自廣州寶泰克公司，常規(guī)藥品購(gòu)自哈爾濱伊事達(dá)公司。

1.2.2 基因組DNA的提取

用改良的CTAB法提取基因組DNA[5]。

1.2.3 RAPD擴(kuò)增反應(yīng)

PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，其中包括Taq酶 1 U，Mg2+2 μL，Buffer（10×）2.5 μL，dNTP 0.2 mmol·L-1，DNA 2 μL（約30 ng），引物5 pmol，不足的體積用超純水補(bǔ)足。

反應(yīng)程序如下：95℃7 min，94℃1 min，41℃1 min，72℃2 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠、電壓100 V、電泳2 h，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代的RAPD分析

從120個(gè)隨機(jī)引物中篩選出28個(gè)引物，這28個(gè)引物均擴(kuò)增5條帶以上，多態(tài)性及其豐富，可用于大果沙棘雜交F1代的RAPD分析，共擴(kuò)增出601條譜帶，其RAPD標(biāo)記分離情況見表2。

表2 7個(gè)大果沙棘雜交組合F1代的RAPD分離方式Table 2 RAPD segregation pattern of F1 of seven big fruit sea-buckthorn hybridization combinations

2.1.1 RAPD標(biāo)記符合孟德爾遺傳分離規(guī)律

RAPD標(biāo)記符合孟德爾遺傳分離規(guī)律的情況分為F1代不分離、按1∶1分離和按3∶1分離。

在F1代不分離的RAPD標(biāo)記既有雙親共有標(biāo)記，也有單親特有標(biāo)記。由表2可以看出，雙親共有標(biāo)記是不分離標(biāo)記的主體，同時(shí)亦是RAPD標(biāo)記分離的主要方式，也反應(yīng)了RAPD標(biāo)記為顯性遺傳標(biāo)記的特征。這類標(biāo)記在F1代個(gè)體中存在與缺失的理論比例應(yīng)為F1代單株數(shù)19∶0，如在雜交組合6中，雙親共有標(biāo)記S31-1 500存在與缺失的比例應(yīng)為19∶0，實(shí)際分離比例為18∶1（見圖1），在統(tǒng)計(jì)學(xué)上符合19∶0的分離比例。又如在雜交組合1中母本特有標(biāo)記S96-500存在與缺失的理論比例和實(shí)際比例分別為27∶0和24∶3（見圖2），在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也是符合的。

F1代按1∶1分離的RAPD標(biāo)記包括母本特有標(biāo)記和父本特有標(biāo)記，如雜交組合2中母本特有標(biāo)記S112-1 000的實(shí)際分離比例為14∶16，雜交組合1中父本特有標(biāo)記S134-800的實(shí)際分離比例為14∶13，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上符合1∶1的比例。

F1代按3∶1分離的RAPD標(biāo)記僅發(fā)生在雙親共有標(biāo)記上，如雜交組合6中S31-300的實(shí)際分離比例為14∶5（見圖1），在統(tǒng)計(jì)學(xué)上符合3∶1的比例。

圖1 引物S31對(duì)雜交組合6的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of primer S31 on hybridization combination 6

圖2 引物S96對(duì)雜交組合1的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification result of primer S96 on hybridization combination 1

2.1.2 RAPD標(biāo)記偏離孟德爾分離規(guī)律

F1個(gè)體中RAPD標(biāo)記存在與缺失的比例，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏離1∶1或3∶1的孟德爾分離比例，如雜交組合7中，母本特有標(biāo)記S167-1 000（見圖3），雜交組合2中雙親共有標(biāo)記S84-800的實(shí)際分離比例分別為9∶13和12∶18，分別偏離了1∶1和3∶1的理論比例。

2.1.3 RAPD標(biāo)記異常分離

異常分離標(biāo)記是指非親RAPD標(biāo)記，即雙親均無(wú)但在F1代出現(xiàn)。本試驗(yàn)共檢測(cè)出24條異常分離的RAPD標(biāo)記，各雜交組合的異常分離的標(biāo)記各不相同，其中雜交組合1和雜交組合6中的異常分離標(biāo)記最多，都為5條，其次是雜交組合2和雜交組合3，都檢測(cè)出4條，異常分離標(biāo)記最少的是雜交組合4，只檢測(cè)出1條異常分離的標(biāo)記。

2.2 不同分離類型的RAPD標(biāo)記的出現(xiàn)頻率

對(duì)各組雜交F1代分離情況進(jìn)行分析可知，在F1代不發(fā)生分離的RAPD標(biāo)記中，雙親共有標(biāo)記不分離占多數(shù)，雙親特有標(biāo)記不分離只占少數(shù)；母本特有標(biāo)記不發(fā)生分離的比例要高出父本特有標(biāo)記的不分離比例。表明雙親共有標(biāo)記在F1代大多不發(fā)生分離，是不分離標(biāo)記的主體。同時(shí)表明，7個(gè)雜交組合中的母本基因組中純合基因位點(diǎn)所占比例均高于父本基因組中純合基因位點(diǎn)所占的比例。

圖3 引物S167對(duì)雜交組合7的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification result of primer S167 on hybridization combination 7

在F1代符合1∶1或 3∶1孟德爾分離比例的RAPD標(biāo)記中，雙親共有標(biāo)記、母本特有標(biāo)記和父本特有標(biāo)記所占比例依次增加，表明單親特有標(biāo)記在F1代多發(fā)生符合孟德爾規(guī)律的分離，是正常分離標(biāo)記的主體。

3 討論與結(jié)論

本研究觀察到7個(gè)雜交組合F1代分別有29.5%、19.8%、32.3%、23.7%、34.4%、25.0%、23.6%RAPD標(biāo)記偏離孟德爾分離規(guī)律。如雜交組合1中，父本特有標(biāo)記S29-780，雜交組合7中，母本特有標(biāo)記S167-1 000等。從已有報(bào)道[6-7]和本研究來(lái)看，不規(guī)則分離的RAPD標(biāo)記往往集中在少數(shù)幾個(gè)連鎖群體，表明不同染色體在雜交過(guò)程中“活躍”程度不同，即發(fā)生結(jié)構(gòu)重排、缺失、插入和突變等的幾率存在變異。

本試驗(yàn)中，7個(gè)雜交組合后代共擴(kuò)增出24條異常分離的標(biāo)記，這些標(biāo)記在雙親的譜帶中均未發(fā)現(xiàn)，其中以引物S84擴(kuò)增的異常分離標(biāo)記最多達(dá)3個(gè)，這些標(biāo)記大多集中在300～800 bp之間。Davis等在鷹嘴豆和二倍體草莓的作圖群體中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)長(zhǎng)度在300～1 350 bp的共顯性RAPD標(biāo)記，認(rèn)為這些帶是雙親所不具備的異源雙鏈體，其泳動(dòng)速度低于兩個(gè)相應(yīng)的親本帶，在PCR擴(kuò)增前將雙親DNA混合可以導(dǎo)致異源雙鏈體的出現(xiàn)[8]。這種由等位RAPD產(chǎn)物形成的非親RAPD可提供共顯性RAPD標(biāo)記，并且能提供新的RAPD多態(tài)性，在研究育種行為以及親緣關(guān)系等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

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