廣東省實驗小鼠自然感染鼠諾如病毒的調查

袁 文，張 鈺，劉忠華，潘金春，王 靜，羅琴芳，黃 韌

（廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監測所，廣州 510260）

諾如病毒（norovirus）屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，無囊膜，二十面體對稱，核酸為單鏈正股RNA。諾如病毒可以感染人和動物，人諾如病毒是人類重要的病原體，90％以上的非細菌性胃腸炎疾病是由該病毒引起［1］。鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）是一種新發現的感染實驗小鼠的病毒，2002年Karst從信號轉導蛋白和轉錄激活因子1（STAT1）以及重組體激活基因2（RAG2）缺陷（RAG2-/-/STAT1-/-）小鼠中，首次發現并分離到了小鼠諾沃克病毒-1（murine norovirus-1，MNV-1）。MNV-1可以導致RAG2-/-/STAT1-/-小鼠發生致死性感染，組織病變主要包括腦炎、腦膜炎、腦脈管炎、肝炎和肺炎［1］。

MNV是目前第一個報道能夠在細胞復制的諾如病毒，它可以在原代巨噬細胞和樹突狀細胞上生長，也可在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7上生長并產生細胞病變［2］。MNV在體外的可復制性為MNV的生物學特性、致病機理和診斷試劑等方面的研究提供了基礎，MNV也是人諾如病毒研究的理想病毒模型。MNV被認為是目前已知的小鼠病毒中最流行的一種病毒，調查發現在北美小鼠中感染率為22.1％（n=12639）［3］，在日本的感染率為13.1％（n=245）［4］。目前國內尚無該病毒感染率的報道，為了解MNV在廣東省實驗小鼠中的自然感染情況，我們對省內一些小鼠繁育設施進行了感染情況的調查，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物

被檢小鼠來自廣東省7個小鼠繁育設施［生產許可證號分別為：SCXK（粵）2008-0020、SCXK（粵）2008-0002、SCXK（粵）2008-0003、SCXK（粵）2008-0008、SCXK（粵）2004-0011、SCXK（粵）2006-0015和SCXK（軍）2007-014］共206只，隨機抽樣，抽樣時按照GB14922.2-2001標準進行，抽樣基數為生產群的數量。206只小鼠經酶聯免疫吸附試驗（試劑盒購自中國藥品生物制品檢定所）檢測血清抗體，確認無淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）、鼠痘病毒（Ect）、仙臺病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo-3）、小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠細小病毒（MVM）、多瘤病毒（POLY）、小鼠出血熱病毒（HV）10種病毒感染。

1.2 主要試劑

AMV反轉錄酶、DNA聚合酶、DNA分子量marker、購自大連寶生物公司。病毒RNA提取試劑盒（Q IAamp Viral RNA Mini Kit）購自Qiagen公司。其余試劑均為進口或國產分析純。

1.3 樣品采集、處理及RNA提取

對所有動物實施安樂死后，無菌采集206只小鼠盲腸內容物，無菌手術在廣東省實驗動物監測所屏障動物實驗設施［SYXK（粵）2009-0019］進行，取適量滅菌的PBS加入裝有樣品的離心管中，漩渦混勻，12000r/min離心10min，取上清液通過0.22μm濾膜（Pall corporation）過濾，使用Q IAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取濾液中病毒的總RNA，提取方法依照說明書進行，RNA保存于-80℃備用。

1.4 RT-PCR

1.4.1 引物：引物參考有關文獻［5］，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物P1：5′-CAGATCACATGCTTCCCAC-3′；下游引物 P2：5′-AGACCACAAAAGACTCATCAC-3′，引物位于MNV序列保守區域衣殼基因編碼區位置，擴增產物大小為187bp，該引物可以擴增MNV-1、MNV-2、MNV-3和MNV-4四種類型毒株。

1.4.2 反轉錄：MNV為正股RNA病毒，因此用下游引物進行反轉錄。在一DEPC處理的0.2mL的Eppendorf管中依次加入以下試劑：5×反轉錄緩沖液4μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，P2（10μmol/L）1μL，AMV反轉錄酶1μL，RNA酶抑制劑0.5μL，RNA模板10μL，加DEPC-H2O至20μL。反應條件：42℃孵育1h，95℃5min滅活反轉錄酶，得到的反應產物為cDNA。

1.4.3 PCR：取反轉錄產物cDNA 4μL作為PCR擴增的模板，再加入10×PCR buffer（含Mg2+）2μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.6μL，P1（10μmol/L）1.5μL，P2（10μmol/L）1.5μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，加ddH2O至20μL。引物的反應參數為：95℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40個循環，最后72℃延伸10min。每次反應均設陰性對照。

1.5 PCR產物鑒定

取5μL PCR產物在2％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以DL2000marker作分子量參照，紫外燈下觀察，拍照。

1.6 PCR產物測序及序列比較分析

經電泳鑒定為陽性的4個PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，并用NCBI網站Blast軟件對其進行核苷酸同源性分析，驗證產物的特異性。

2 結果

2.1 部分樣本RT-PCR電泳結果

RT-PCR擴增產物凝膠電泳后，用紫外線燈觀察，陽性樣本在187bp位置有一條目的條帶，與預期結果相符（圖1）。

1-12：樣本；M：DNA markerDL2000圖1 部分樣本RT-PCR電泳結果Lane 1-12：samples；LaneM：DNA markerDL2000Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products from some of the samples

2.2 PCR產物測序結果

測序結果表明PCR產物大小為187bp，4個產物序列一致。應用NCBI網站Blast軟件對其進行序列比較分析，發現與GenBank中登錄的不同年份和不同國家MNV毒株的核苷酸同源性在95.2％以上（表1），證實引物所擴增的片斷為MNV基因。

2.3 廣東省MNV感染情況調查結果

206份樣本中有77份為陽性，陽性率為37.38％。各小鼠繁育設施抽樣情況及MNV感染情況見表2，從表中可以看出7個設施中有4個設施小鼠未發生MNV感染，另外3個設施小鼠感染率很高。卡方檢驗分析表明發生MNV感染的3個設施之間感染率差異無顯著性（P＞0.05），3個發生MNV感染的設施中各品系小鼠之間的感染率差異無顯著性（設施A：P＞0.05，設施B：P＞0.05，設施C：P＞0.05）。

表1 MNV PCR產物序列核苷酸同源性分析Tab.1 Nucleotide sequence analysis of MNV detected from the feces of mice

表2 不同小鼠繁育設施各品系小鼠的MNV感染情況Tab.2 TheMNV infection rate in variousmice strains at different breeding facilities

表3 小鼠繁育設施A、B、C中各品系小鼠的MNV感染總體情況Tab.3 The total MNV infection rate of various mice strains at breeding facility A，B and C

3個發生自然感染的設施中各品系小鼠的MNV總體感染情況見表3。卡方檢驗表明各品系小鼠之間的感染率無顯著差異（P＞0.05）。近交系（19/22，86.36％）、封閉群（23/35，65.71％）和免疫缺陷小鼠（35/52，67.31％）之間感染率無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

自2003年Karst等［1］首次報道MNV以來，MNV被認為是目前小鼠中最流行的一種病毒。MNV感染的診斷主要通過血清學方法，Hsu建立了一種高通量的新型血清學檢測方法流式熒光微球檢測技術，檢測發現小鼠飼養設施中自然感染MNV非常普遍［3］。RT-PCR方法也是診斷MNV感染的有效方法［5］，該方法可以直接檢測多種樣本如糞便、器官和組織等，敏感性比血清方法高。國內尚無小鼠感染該病毒的報道，也沒有相關的抗體檢測EL ISA試劑盒，因此我們采用敏感性更高的RT-PCR檢測方法。由于沒有陽性對照樣本，為了驗證產物的特異性，我們對部分陽性擴增產物進行測序分析，并與GenBank中登錄的MNV毒株進行了核苷酸同源性比較，結果證實擴增產物為MNV基因。

從檢測結果我們發現受調查的7個繁育設施中有3個設施的小鼠MNV感染率非常高，而其他4個設施的感染率為零，統計分析表明發生MNV感染的3個設施之間感染率無顯著差異，各個設施中各品系小鼠之間的感染率也無顯著差異，各品系小鼠均對MNV易感。造成MNV感染的原因可能是3個設施所屬單位在動物飼養管理中存在漏洞，導致病毒由外界傳入。而MNV持續性感染的特性也加速該病毒的傳播，導致感染率上升。MNV主要經糞-口途徑傳播、也可以經呼吸道傳播［6］，研究發現小鼠經口接種MNV后通過糞便持續地向外排毒，至少在感染后8周仍可以從糞便和組織中檢測到病毒核酸，表現出很強的持續性感染［3，5］，因此很難通過檢測和淘汰（test-and-removal）方法從受污染的設施徹底根除MNV［7］。研究發現小鼠經口接種感染后第60天，在卵巢和子宮沒有檢測到病毒，因此剖腹產應當是凈化MNV的有效方法［4］。此外，綜合3個發生感染的設施中各品系小鼠感染數據，我們發現各品系小鼠之間的感染率無顯著差異，所有近交系、封閉群和免疫缺陷小鼠均對MNV易感，感染率無顯著差異，說明MNV感染無品系特異性。

目前沒有證據表明MNV是否干擾小鼠實驗研究，但是MNV對幾種免疫缺陷小鼠有致病性。研究發現MNV-1可以導致一些固有免疫系統應答組分缺陷的小鼠RAG2-/-/STAT1-/-、STAT1-/-、STAT1-/-/PKR-/-和IFNαβγR-/-發生致死性感染［1］。一些自然感染MNV的RAG1-/-/IFNγR-/-和RAG1-/-/STAT1-/-免疫缺陷小鼠臨床癥狀表現為體重下降、翹毛和弓背，病理分析發現小鼠有中度到重度的肝炎、中度間質性肺炎和偶發的腹膜炎［8］。而野生型小鼠、其他一些免疫缺陷小鼠如RAG1-/-和RAG2-/-接種MNV后不發生死亡，也不表現出臨床癥狀［1］。在實驗過程中我們未發現抽檢的小鼠表現出異常的癥狀和眼觀病理變化。

鑒于MNV在小鼠中如此高的感染率以及對一些免疫缺陷小鼠產生致病性，我們應當予以重視，加強動物的飼養管理。由于MNV是一種新發小鼠病毒，國內對MNV的研究工作尚未深入展開，需加強國內MNV感染狀況、致病性、檢測技術等方面的研究。

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