熱休克蛋白70的生物學功能及應用的研究進展

武漢工業學院 楊震國

熱休克蛋白（HSP）是指所有生物細胞在應激原（包括原核細胞及真核細胞在受熱、生物應激、理化因素等）誘導下所產生的高度保守的一組蛋白質，根據其分子質量大小可將HSP分為HSP 110、HSP 90、HSP 70、HSP 60 和 HSP 28 等 5 個家族。HSP 70是熱休克家族中研究最為深入的一種。近年來，許多試驗研究表明，HSP 70具有分子伴侶、抗細胞凋亡、抗氧化和免疫調節等功能，適量的HSP 70對于動物機體及人類的急性胰腺炎、常見肝病治療、腸黏膜保護和急性肺損傷等都具有非常重要的作用。

1 HSP 70的結構及其分類

1.1 HSP 70的結構組成 一般認為，HSP 70蛋白包括ATP酶區、多肽結合區（或底物識別區）和功能不明區三部分。

1.1.1 ATP酶區 ATP酶區位于HSP 70蛋白的氨基端，包括385個氨基酸殘基，相對分子質量為44 ku，此區域高度保守，具有水解ATP的活性。HSP 70的ATP酶區在結構上與己糖磷酸激酶和肌動蛋白的ATP酶區有著高度的同源性（陳蘭英等，2004）。

1.1.2 多肽結合區 多肽結合區位于HSP 70蛋白的羧基端，分子質量約27 ku，由底物結合域和可變動功能域組成，具有結合未折疊多肽的功能。Kumaraguru等（2002）認為，HSP 70的多肽結合區能與主要組織相容性復合物抗原結合，能夠協助區分體細胞和入侵細胞。

1.1.3 功能不明區 功能不明區包括近C端大小為10 ku結構多變氨基酸序列，具體的作用機制現在還不明確。

1.2 HSP 70的分類 HSP 70家族主要包括4類蛋白質：（1）結構型HSC 70（Heat shock cognate 70，p 73），存在于細胞漿中，在所有的細胞內均能表達，是哺乳動物細胞內的結構蛋白，外界應激原刺激后只有少量增加；（2）誘導型 HSP 70（p 72），存在于細胞核中，在正常細胞內表達量較少，細胞發生應激后，表達量迅速增加；（3）葡萄糖調節蛋白 78（GRP 78），位于內質網上；（4）葡萄糖調節蛋白 75（GRP 75），位于線粒體內。 GRP 78和 GRP 75在機體受到應激時稍有表達，它們在細胞內分別以分子伴侶的形式發揮作用（任寶波等，2005）。

2 HSP 70的主要生物學功能

2.1 分子伴侶 HSP 70是一種非特異性的細胞保護蛋白，是目前發現的主要分子伴侶蛋白之一。在應激狀態下，動物機體的蛋白質代謝會發生紊亂，某些蛋白質肽鏈伸展、失去原有盤旋及折疊狀態、分子空間構型改變甚至使寡聚復合物解聚，以致喪失原有功能。此時，HSP 70可作為分子伴侶，與新生、未折疊、錯折疊或聚集的蛋白質結合，使這些蛋白質聚集物解離，從而減少產生不溶性聚集物的危險性，并加速肽鏈的正確折疊和重折疊，最終調節蛋白質的正常合成與代謝。HSP 70同時還促進某些變性蛋白質的降解和清除，重新激活某些酶，維持細胞的正常生理功能（Diamant等，2000）。

2.2 抗細胞凋亡 有害應激包括熱休克、氧化應激等可以導致細胞程序性死亡，即細胞凋亡。HSP 70現在被認為是一種抗凋亡蛋白，但其作用機制比較復雜。Beere等（2000）研究證實，HSP 70可以在誘導凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）合成后，與之結合，同時阻止caspase-9前體被聚集到A-paf-1凋亡蛋白體上，從而阻斷了功能性凋亡蛋白體的裝配，抑制細胞凋亡。另外，HSP 70還可能通過抑制應激激酶P 38的活性發揮抗細胞凋亡作用。Yin等（2001）研究報道，HSP 70的陽性率與細胞凋亡指數成正比。

2.3 抗氧化 Hiratsuka等（1999）研究證明，用轉基因的方法誘導呼吸上皮細胞表達HSP 70，可以減輕高濃度氧或H2O2介導的蛋白氧化、脂質過氧化、中性粒細胞浸潤和細胞凋亡，防止ATP耗竭，從而起到細胞保護作用。HSP 70發揮抗氧化作用的機制很可能是：（1）HSP 70抑制氧自由基的關鍵酶即NADPH氧化酶的產生，通過反饋作用減少氧自由基；（2）HSP 70直接釋放內源性過氧化酶如超氧化物歧化酶，使機體內源性抗氧化劑合成和釋放增加，對隨之而來的應激有較強的抵抗作用。

2.4 免疫調節 Schett等（1998）研究認為，細胞外HSP 70來源于細胞內的HSP 70的釋放。細胞外的HSP 70通過其受體的介導來對免疫細胞的功能進行調節。動物機體內許多的細胞表面均存在細胞外HSP 70受體，例如，自然殺傷細胞（NK細胞）、中性粒細胞、B細胞和單核巨噬細胞等。

正常狀態下，核轉錄因子-κB（NF-κB）與其抑制蛋白（IκB）結合成復合物后存在于細胞液中，此時NF-κB處于失活狀態。當細胞受到刺激（感染、氧化和抗原等）時，IκB發生磷酸化后被相應的蛋白酶降解，NF-κB被激活。NF-κB隨即通過核膜上受體進入細胞核與靶基因κB位點結合，迅速誘導靶基因轉錄，形成的大量的炎性介質（如IL-1、TNF-α 等），引起炎癥反應。

Chan等（2004）試驗證實，HSP 70可與 NF-κB結合，從而阻斷NF-κB向細胞核移位。與此同時，HSP 70可誘導IκB合成，也可通過阻止IκB磷酸化而抑制IκB降解，從而增加IκB的含量，抑制NF-κB活化，最終使HSP 70參與機體的免疫調節。此外，細胞外HSP 70可以作為免疫肽傳送者，誘導細胞因子的釋放或為NK細胞提供識別位點，從而對機體組織器官起到免疫保護作用。

3 HSP 70在疾病治療方面的應用

3.1 HSP 70與急性胰腺炎 試驗證實，預先誘導胰腺HSP 70表達具有保護由精氨酸、蛙皮素、丁基氯化錫（DBTC）誘導的大鼠急性胰腺炎的作用。Bhagat等（2002）在動物模型體內注射HSP 70反義引物，抑制熱應激誘導HSP 70表達，恢復了最大量蛙皮素引起胰腺內胰蛋白酶原的激活能力，淀粉酶和胰蛋白酶原激活肽（TAP）水平升高，結果發現預先熱應激的保護作用失效。另有研究報道，由亞砷酸鈉誘導大鼠體內HSP 70高效表達的情況下，蛙皮素和精氨酸誘導的胰腺炎得到緩解（Bhagat等，2008）。Grise等（2000）發現，預先熱休克可以保護乙硫酸食物（CDE）誘發小鼠壞死型胰腺炎。Qiu等（2006）研究發現，HSP 70通過抑制白細胞介素和誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）的生成而起保護胰腺生理功能作用。

總而言之，HSP 70可能是通過干擾溶酶體酶／消化酶原的共區域化和溶酶體酶使腺泡內胰蛋白酶原活性降低而起到保護胰腺的作用。

3.2 HSP 70與肝病治療 肝癌（HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發生發展過程漫長而又復雜。王星輝等（2008）對78例肝硬化患者標本進行試驗后，發現HSP 70可能作為主要的抑制凋亡蛋白參與HCC的凋亡調控。Fidlay等（1988）的研究表明，HSP 70作為一種應激蛋白在HCC中高表達，可能與P 53突變有關。HSP 70能與突變型P 53選擇性結合成穩定復合物，使細胞核內P 53蛋白轉運到細胞漿中，從而喪失控制細胞增殖的負調控能力。

陳輝等（2002）對肝細胞生長因子（HGF）研究后發現，HGF通過誘導HSP 70合成來抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）所介導的肝細胞凋亡，這對于肝功能衰竭的治療提供了新思路。

但近年來有學者則認為，熱休克反應是應激反應的一種，嚴重創傷時它會出現過度反應，這時產生的HSP 70與正常生理和一般性應激反應情況下的HSP 70可能存在著功能性的差異，動物應激后高效表達的HSP 70可能對肝臟造成繼發性損傷。有試驗發現，HSP 70在機體嚴重創傷后的高表達，可能會影響糖皮質激素抗炎功能的發揮，從而導致創傷后繼發性肝損傷，但其作用機制則有待進一步研究（朱梅菊等，2005）。

3.3 HSP 70與腸黏膜保護 黏膜防御屏障與損傷因子或涉及到黏膜損傷形成的過程之間的平衡是非常重要的。腸道不僅是消化、吸收和營養物質交換的重要場所，也是人體最大的免疫器官，而黏膜屏障是腸道最重要的一道屏障。腸道上皮細胞（IEC）是腸黏膜屏障的重要組成部分，它們是阻止抗原進入機體免疫系統的重要屏障，對有害病原菌產生免疫防御。Ohkawara等（2006）研究認為，作為細胞內保護者的熱休克蛋白對腸道上皮細胞有重要的保護作用。Jin等（1997）報道，熱處理產生的HSP 70對腸黏膜具有保護作用。袁志強等（2003）證實，亞砷酸鈉誘導的 HSP 70表達增加可明顯減輕大鼠嚴重燙傷后早期的腸黏膜屏障破壞，降低腸黏膜通透性，減少腸道內毒素移位。Odashima等（2000）通過鋅L型肌肽誘導大鼠直腸內HSP 70的表達的研究發現，HSP 70可以通過抑制NF-κB的激活來提高對腸黏膜的保護功能。Ehrenfried等 （1995） 和 Wischmeyer等（1997）則認為，谷氨酰胺（Gln）對腸道的保護作用是通過誘導HSP 70的表達而產生的。

綜上所述，HSP 70可能通過多種途徑參與腸黏膜的保護，它可能通過對IEC進行細胞保護而間接地維持黏膜防御屏障與損傷因子或涉及到黏膜損傷形成的過程之間的平衡。

3.4 HSP 70與急性肺損傷的保護作用 肺是感染性疾病、膿毒癥常累及的靶器官，常并發急性肺損傷。其病理特點為肺泡毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，表現為廣泛肺水腫和微小肺不張。臨床上表現為低氧血癥、呼吸頻速和X線胸片出現雙肺彌漫性浸潤。Hiratsuka等（1999）對大鼠靜脈注射載有HSP 70基因的腺病毒，使其肺組織細胞大量表達HSP 70后，取出肺臟進行移植，則肺動脈血氧含量明顯高于對照組，并且肺濕/干比率和肺組織髓過氧化物酶活性均顯著降低，明顯的緩解了急性肺損傷癥狀。Wischmeyer等（2003）報道，用谷氨酰胺預處理，可以減輕細菌脂多糖（LPS）誘導的組織損傷，促進大鼠肺等組織細胞中HSP 70表達，減少外周血單核細胞致炎因子的釋放，而這一機制可能是通過誘導HSP 70表達增加實現的。于東云等（2006）采用LPS誘導Wistar大鼠急性肺損傷，觀察由此引起的支氣管、細支氣管和肺上皮細胞HSP 70應激性表達，免疫組織化學陽性細胞率和蛋白免疫印跡（Western blotting）結果均高于正常對照組，提示HSP 70參與肺損傷后組織保護作用。目前認為，細胞凋亡是急性肺損傷發病機制之一。因此，HSP 70可以通過抑制肺組織細胞凋亡保護急性肺損傷，但確切的作用機制目前尚無定論。

4 小結與展望

HSP 70具有較強分子伴侶、抗細胞凋亡、抗氧化、免疫調節等功能。HSP 70在應激狀態與正常生理狀態的表達水平存在顯著差異，其是否可以作為監測指標，用于評價不同動物機體的環境適應能力、身體健康狀況以及應激程度等有待進一步研究。另外，尋找對機體無損傷或損傷小的強HSP 70誘導劑，以便發揮HSP 70功能來保護動物免遭有害因素損害，也是其推廣應用急待解決的問題。

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