狐貍源維里納氣單胞菌的分離鑒定

劉 燕,應月青,趙 京,張成林,閻 鶴

(1.北京動物園,北京 西城 100044;2.北京市產品質量監督檢驗所,北京朝陽 100026)

氣單胞菌屬為水中常居菌,是水生生態系統中重要的病原菌,致病范圍廣泛,可引起多種水產動物感染發病[1]。該屬主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、維里納氣單胞菌(Aeromonas veronii)等。相比該屬中的其他細菌,維里納氣單胞菌報道相對少些。2009年9月中旬,我園多只狐貍相繼出現土灰色稀軟便,精神沉郁,不愛運動,無食欲的癥狀。其中兩只銀狐和一只白狐出現癥狀一天就死亡,其他經治療后恢復。取死亡狐貍心血和肝臟,經病原菌檢驗,分離到一株維里納氣單胞菌,該菌株毒力較強判定為致病菌。具體情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本園圈養的兩只銀狐和1只白狐;所用儀器包括立式高壓蒸汽滅菌鍋、光學顯微鏡、冰箱、超凈工作臺、恒溫培養箱等;有氧血培養瓶和API細菌鑒定系統試劑條均購于法國梅里埃生物有限公司;脫纖維羊血、營養瓊脂培養基等均購于北京陸橋生物技術有限公司;我園自養健康小鼠,體重均約25 g左右。

1.2 分離培養 分別取死亡狐貍心血和肝臟,對血液涂片進行姬姆薩染色,對肝臟組織觸片進行革蘭染色。同時,將血液接種于有氧血培養瓶,于37℃條件下培養24～48 h;肝臟組織接種于血液瓊脂培養基,分別置于有氧和厭氧兩種環境下,于37℃條件下培養24～48 h。

1.3 形態學觀察 對培養出的細菌菌落進行觀察,記錄其特征;純培養物經革蘭染色后,觀察細菌的個體形態及染色特征;用懸滴法在暗視野下觀察細菌的運動性。

1.4 生化特性鑒定[2]挑取純化的細菌的單個菌落分別做氧化酶、觸酶、糖發酵等試驗,鑒定其生物學特性。

1.5 半自動鑒定系統鑒定 根據染色結果、氧化酶和觸酶試驗結果,選擇合適的法國梅里埃公司API細菌鑒定系統試劑條進行鑒定。

1.6 致病性 分離純化的菌株,采用普通瓊脂培養基培養24 h,用無菌0.85%生理鹽水沖洗菌苔,參照麥氏比濁法測定菌液濃度后稀釋至一定濃度,腹腔注射健康25 g體重小鼠測定其致病力。

2 試驗結果

2.1 死亡狐貍臨床癥狀及病理剖檢變化 3只狐貍在發病癥狀、剖檢病理變化和病理切片等方面都表現出很高的相似性。具體如下:發病癥狀為土灰色稀軟便,有時便中帶血,精神沉郁,不愛運動,無食欲,死亡時肛門有出血;剖檢病理變化為腸道積氣,小腸段漿膜出血明顯,胃腸空虛,胃幽門區有出血斑,心肌有出血點,切面內膜出血點,肺出血斑點,左肺大面積突變,腎盂部出血,肝表面顏色不均,局部壞死;病理組織切片病變為心肌細胞大量發生壞死,萎縮,肝臟有細菌團塊,脾臟有較多的局灶性淋巴細胞增多,肺淤血較嚴重,有淋巴細胞浸潤,肺泡塌陷。

2.2 分離培養結果 肝臟組織觸片見到陰性小桿菌,血涂片經姬姆薩染色見到紫色小桿菌。厭氧培養未分離到細菌。血液和肝臟于有氧條件下均分離到一株較純細菌。該株細菌革蘭染色陰性,桿狀(有的稍彎曲),也有接近球狀,兩端鈍圓,無芽孢,單個、成雙或短鏈 ,大小多在 0.3 ～0.7 μ m ×1.2～ 2.5 μ m的細菌。該細菌有運動性。在普通營養瓊脂上其菌落特征為圓形光滑、邊緣整齊、灰白色、不透明,培養24 h菌落直徑多在1.2 mm左右(稍隆起),48 h多在1.8 mm左右(較扁平),生長豐盛;在血瓊脂培養基上的菌落圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、近乳白色、β-溶血,亦生長豐盛。

2.3 生化試驗結果 氧化酶(+),觸酶(+),阿拉伯糖產酸(-),乳糖產酸(-),麥芽糖產酸(+),半乳糖產酸(+),棉籽糖(-),吲哚(+),V-P反應(+),七葉苷水解(+),H2S產生(-),水解尿素(-),丙二酸利用(-),硝酸鹽還原(+),ONPG(+)。根據該生化試驗結果判定為維里納氣單胞菌。

2.4 API鑒定系統鑒定結果 本菌株為氧化酶陽性、觸酶陽性的陰性小桿菌,選擇API20E鑒定試紙條進行鑒定。鑒定結果為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila),鑒定率為80%。

2.5 致病性試驗結果 將該菌株24 h培養物稀釋至一個麥氏單位,腹腔注射體重為20～30 g的小鼠,對照注射普通肉湯。設置0.25 mL、0.5 mL、1 mL 3種注射量(因小鼠數量有限,每種注射量各注射1只小鼠)。結果除對照外其他小鼠均于6 h內死亡。并從死亡小鼠的心血中分離到較純的維里納氣單胞菌。說明該菌是小鼠死亡的致病菌株。

3 結果與討論

API鑒定系統鑒定結果和生化試驗鑒定結果不完全符合,而且鑒定百分率也只有80%。分析原因是因為本試驗使用的API鑒定系統的數據庫中不包含維里納氣單胞菌。根據生化試驗結果,認定該菌株應為維里納氣單胞菌(Aeromonas veronii)。動物試驗結果表明,該菌株毒力很強,可以肯定為這次狐貍發病甚至導致死亡的病原菌。該菌株已申請保存于中國獸醫藥品監察所附屬的中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

維里納氣單胞菌是于1983年為紀念法國微生物學家Véron而命名的新種。該菌主要引起水產動物致病,如斑點叉尾鮰、錦鯉、泥鰍、中華絨螯蟹[3]等等,是水中的常居致病菌。對非水產動物以及人類致病主要通過飲水、食用魚類或傷口接觸水被感染等發生。可以引起動物或人食物中毒[4]、水源性腸道疾病以及死亡等等。預防該菌屬的流行主要通過加強飲水、食品衛生來控制。

[1]周庭銀.臨床微生物學診斷與圖解[M].上海:上海科學技術出版社,2007:193-195.

[2]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:117-119.

[3]房海,陳翠珍,張曉君,等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗[J].中國人獸共患病學報,2008,24(1):45-49.

[4]楊守明,幾起嗜水氣單胞菌引起的食物中毒流行病學特征分析[J].中華疾病控制雜志,2009,13(2):206-207.