飼用木聚糖酶的研究進展及應用

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所 丁 強

當前玉米等常規(guī)飼料原料供應日趨緊張，可將麥類及雜粕類等非常規(guī)原料用于飼料生產(chǎn)以降低養(yǎng)殖成本，但其含有一定量的抗營養(yǎng)因子，飼料利用效率較低。研究表明，添加木聚糖酶可以提高麥類及雜粕類等非常規(guī)飼料的飼料轉化效率，促進養(yǎng)分的消化吸收，維持腸道微生態(tài)以及降低污染。目前，已將不同來源的木聚糖酶應用于畜禽及水產(chǎn)生產(chǎn)中，并取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益。本文就木聚糖酶的研究進展及其在飼料中的應用進行綜述。

1 木聚糖酶的研究進展

1.1 木聚糖酶的分子結構域 木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱。內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶（EC3.2.1.8）作用于木聚糖主鏈，隨機切開木聚糖內(nèi)部的木糖苷鍵，將其分解為低聚糖。不同來源的木聚糖酶在結構和性質(zhì)上有很大的差別。有的木聚糖酶只含有單一區(qū)域即催化區(qū)，有的同時具備催化區(qū)和多種非催化區(qū)。多區(qū)域木聚糖酶分子結構中含有催化區(qū)（Catalytic domain，CD）、纖維素結合區(qū)（cellulose-binding domain，CBD）、 木聚糖結合區(qū) （xylan-binding domain，XBD）、錨定區(qū)（dockerin domain，DD）、連接序列 （linker sequence）、 重復序列 （repeated sequence）、熱穩(wěn)定區(qū)（thermostabilising domain）及其他未知功能的非催化區(qū)等，這些區(qū)域承擔著不同的生理功能。

木聚糖酶的催化區(qū)承擔著酶的水解功能，并作為該酶分類的基礎。雖然不同木聚糖酶分子在其氨基酸組成的數(shù)目和種類上相差很大，但其催化區(qū)大小比較一致。谷氨酸和天冬氨酸在催化區(qū)的特定位置是決定其催化特性的關鍵因素。研究表明，同一族的木聚糖酶的催化結構域具有同源性。Zui等（2000）發(fā)現(xiàn)，有6種以上第10族木聚糖酶的催化區(qū)表現(xiàn)高清晰度的X－Ray結構。木聚糖酶的底物結合區(qū)差異較大，一些木聚糖酶的底物結合區(qū)對木聚糖有特異性，所以又稱之為木聚糖結合區(qū)（XBD）。一般這些底物結合區(qū)并不影響酶的催化活性，但對不溶性底物有著特殊作用。木聚糖酶分子中的功能區(qū)域之間由連接序列相連，此序列的長度變化很大，一般為6～59個氨基酸（Black等，1994）。該序列中或含有較多的絲氨酸殘基，或含有較多的脯氨酸和蘇氨酸，不同來源木聚糖酶的連接序列間的同源性一般不高。

1.2 酶的家族 Henrissat等（1989）按照酶催化結構域的初級結構將常見的糖苷水解酶分為不同的家族，到2005年達到96個家族。同一家族的酶具有相似的三維結構和分子機制。在這一分類系統(tǒng)中，一般認為木聚糖酶僅局限于家族10和11。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在 5、7、8、16、26、43、52 和 62家族中也有酶具有木聚糖酶活性。在這一分類系統(tǒng)中，10和11家族是最主要的木聚糖酶家族。10家族不僅包括內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶，還包括內(nèi)切-1，3-β-木聚糖酶和纖維二糖水解酶等其他酶系。這一家族的酶具有高分子量低等電點，分子結構中有（α/β）8 桶狀結構（Lo等，1999）。 與 10 族木聚糖酶相比，11家族的酶具有較多的底物結合位點，主要作用于長鏈的木寡糖，作用產(chǎn)物可以被10族木聚糖酶進一步分解（Biely等，1993）。

1.3 木聚糖酶的理化性質(zhì) 微生物木聚糖酶是分子質(zhì)量在8～145 kDa的單亞基蛋白質(zhì)。來源于真菌或細菌的內(nèi)切型木聚糖酶的最適溫度一般為40～60℃。通常細菌所產(chǎn)木聚糖酶熱穩(wěn)定性比真菌所產(chǎn)木聚糖酶好。不同微生物所產(chǎn)木聚糖酶所能耐受的pH值為3～10，最適pH值一般為4～7。不同木聚糖酶的等電點為3～10（Kulkarni等，1999）。許多真核微生物所產(chǎn)木聚糖酶可發(fā)現(xiàn)糖基化的現(xiàn)象，通常認為糖基化與酶抵御極端環(huán)境維持其穩(wěn)定性相關。不同的糖基化作用和蛋白酶解是木聚糖酶多樣性的重要原因之一。

1.4 木聚糖酶的基因工程 Panbangred和Fukusaki（1985）首次利用大腸桿菌表達矮小芽孢桿菌（Bacillus.pumilus IOP）β-木聚糖酶。隨后已有數(shù)十種不同來源的木聚糖酶基因在原核生物表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了表達。由于克隆的木聚糖酶基因表達水平往往比在原始菌株中低，許多研究者嘗試通過改變宿主菌和使用具有高效表達啟動子的載體構建新型高效表達基因工程菌，這不但可以提高酶的表達量而且使一些木聚糖酶能分泌到胞外 （Ruller等，2006；Ernst等，1990；Whitehead 和Hespell，1990）。

目前，對木聚糖在不同真核系統(tǒng)中的表達也進行了研究。在真核基因的表達系統(tǒng)中應用最普遍的是酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、動物乳腺表達系統(tǒng)、絲狀真菌外源表達系統(tǒng)、植物基因表達系統(tǒng)以及T7RNA聚合酶-Φ10啟動子偶聯(lián)表達系統(tǒng)等。研究證實，酵母表達系統(tǒng)作為成熟的表達系統(tǒng)已使多種不同來源的木聚糖酶實現(xiàn)了高效表達（張紅蓮等，2003；Moreau 等，1992）。

研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物和植物中也可表達木聚糖酶基因。Fontes等（1999）將來源于Clostridium thermocellum的木聚糖酶基因XYLY'轉入哺乳動物細胞MDCK和轉基因小鼠的胰臟實現(xiàn)了木聚糖酶的表達。楊培龍等（2006）發(fā)現(xiàn)，來源于橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis）A1 的木聚糖酶XYNB在煙草中可高效表達木聚糖XYNB，所表達的目的蛋白約占葉片總蛋白含量的6%，酶活性約為170 IU/g鮮葉片。

由于木聚糖酶在天然材料中表達水平低，難以大規(guī)模生產(chǎn)，并且產(chǎn)物難以純化，因而木聚糖酶尚未得到廣泛應用。通過基因工程在分子水平上對木聚糖酶基因進行改造，可以提高木聚糖酶的應用價值。陸建等（2002）和楊浩萌等（2006）分別對木聚糖酶的比活性和熱穩(wěn)定性進行了有效的改良，提高了其應用潛力。

2 木聚糖酶在飼料中的應用

2.1 家禽日糧 木聚糖酶在家禽日糧中的應用較為廣泛。研究表明，木聚糖酶能有效促進飼料營養(yǎng)物質(zhì)的吸收消化，提高家禽的生產(chǎn)性能。徐駿等（2007）報道，添加0.05%木聚糖酶使試驗組仔雞增重提高，而料重比降低。王海英等（2003）在小麥日糧中添加木聚糖酶后，肉雞耗料增重比和小腸食糜黏度顯著降低，死淘率降低71.9%，能量利用率和蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉的消化率顯著提高，改善了肉仔雞的生產(chǎn)性能，達到甚至超過玉米日糧的飼喂效果。廖細古等（2006）試驗表明，在玉米-豆粕型日糧中添加250 g/t和500 g/t的木聚糖酶，可以使整個階段肉鴨生長增重分別比正對照組提高2.77%和4.96%；料重比分別下降1.85%和2.11%。木聚糖酶也可以用于提高日糧的表觀代謝能（AME）。王修啟（2003）在肉雞的不同小麥型日糧中添加木聚糖酶，AME提高了6.53%～7.07%。王金全等（2004）報道，添加木聚糖酶能夠提高肉雞糞AME，并且隨著日糧中小麥水平的提高，AME的提高幅度越大，木聚糖酶在1～3周齡肉雞的效果顯著好于4～6周齡。研究表明，木聚糖酶還有利于提高家禽對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。王修啟（2003）在肉雞不同小麥日糧中添加木聚糖酶，提高了干物質(zhì)和有機物的消化率。譚權和張克英（2008）試驗表明，添加3000 IU/kg木聚糖酶對小麥的干物質(zhì)、能量和粗蛋白質(zhì)利用率提高幅度最大。

2.2 家畜日糧 木聚糖酶的添加也可以促進纖維在反芻動物瘤胃中的消化。Beauchemin（2000）在育肥期公牛大麥基礎日糧中添加高活性的木聚糖酶制劑，其飼料轉化率提高11%，采食量降低5%。Yang等（2000）使用含有高活性的木聚糖酶和纖維素酶的復合酶有效提高了奶牛的全消化道消化率。還有研究表明，木聚糖酶制劑會影響奶牛產(chǎn)奶量。Kung等（2007）報道，低劑量復合酶處理（每千克飼料含纖維素酶3500 IU和木聚糖酶16000 IU）能提高日產(chǎn)奶量。穆天龍（2008）的研究也獲得類似的結果，最佳復合酶制劑用量是2∶1的纖維素酶和木聚糖酶，大約是每千克干物質(zhì)的粗飼料添加3500 IU的纖維素酶和13350 IU的木聚糖酶。袁巧靈和張美麗（2006）報道，在雜交仔豬飼料中添加木聚糖酶，其日增重和飼料轉化率分別比對照組提高了22.32%和7.25%，試驗組仔豬腹瀉發(fā)病率比對照組降低了10%，表明在日糧中添加木聚糖酶可提高日糧中養(yǎng)分的消化率，降低仔豬腹瀉發(fā)病率，對仔豬的生長性能具有明顯改善作用。俞沛初等（2005）研究表明，添加木聚糖酶可顯著提高仔豬對能量、干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分的表觀消化率，同時結果還顯示，添加外源性酶可刺激仔豬腸道某些內(nèi)源性消化酶的分泌。

2.3 水產(chǎn)動物日糧 高春生等（2006）報道，在基礎飼料中添加0.05%～0.2%木聚糖酶飼喂草魚，結果發(fā)現(xiàn)草魚增重率提高，餌料系數(shù)降低，干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗纖維的消化率提高。目前有關水產(chǎn)用飼料中飼用酶制劑的研究及應用較少。水產(chǎn)動物消化道pH一般呈中性或微堿性（李馨等，2009）。因此，水產(chǎn)用木聚糖酶的研制應以開發(fā)獲取中性或堿性等性質(zhì)適宜的木聚糖酶為主。

3 木聚糖酶在飼料中應用存在的問題

3.1 穩(wěn)定性 目前，飼用木聚糖酶主要來源于細菌、鏈霉菌、曲霉、青霉和木霉等微生物。真菌木聚糖酶的活性通常高于細菌木聚糖酶，但是耐熱穩(wěn)定性低于細菌來源。溫度和pH值是影響酶有效性的關健因素。由于飼料制粒過程中有一個短暫的高溫過程和動物胃腸道內(nèi)寬泛的pH值條件，理想的的飼用木聚糖酶應是耐高溫和在廣泛的pH范圍內(nèi)仍能保持高酶活的酶種。針對此問題，一方面可以通過多種選育方式篩選耐高溫的產(chǎn)酶菌株，另一方面也可以通過生物工程手段對已有酶種進行有效改良，產(chǎn)生具有多種優(yōu)良工業(yè)性質(zhì)的復合酶。目前，一些酶制劑生產(chǎn)工藝條件粗放（如高溫、高壓、重金屬離子、氧化劑和極端pH條件），天然酶的酶活性會遭到極大破壞，使酶的生產(chǎn)和使用受到限制。固體發(fā)酵飼料用酶制劑生產(chǎn)工藝還不成熟，造成產(chǎn)品質(zhì)量不如液體發(fā)酵穩(wěn)定，在生產(chǎn)中有時帶入雜菌，給應用帶來一定的不利因素（張曉暉等，2006）。

3.2 添加量 有關木聚糖酶在不同飼料中的添加水平報道并不一致。在實際使用時應考慮不同產(chǎn)品的酶活性、飼喂對象、生理階段以及飼料組合，否則可能因用量不當難以達到最優(yōu)的應用效果。

3.3 酶活性檢測 酶活測定方法的不同會導致評估工作的困難，長時間以來不同的研究人員已對木聚糖酶的活性測定方法進行了摸索。GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法》已于2009年10月1日開始實施，為今后飼用木聚糖酶的活性測定制定了統(tǒng)一的標準。

4 結語

飼料業(yè)的快速發(fā)展對當前的飼用酶制劑的生產(chǎn)開發(fā)提出了更高的要求。利用多種手段篩選分離改良最終獲得性質(zhì)優(yōu)良的飼用木聚糖酶，對緩解我國飼料資源的不足，提高飼料的利用率以及動物的生產(chǎn)性能起到巨大的推動作用。另外，在加強產(chǎn)業(yè)化的同時，還應對木聚糖酶的作用機制及促生長機理進行深入研究，以期研制出更適合于不同飼料原料和需求的酶制劑產(chǎn)品，更好推動木聚糖酶在飼料中的廣泛應用。

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