兔在體心臟缺血再灌注模型的制作方法的改進

薛 楓,楊向軍,李 勛,韓蓮花,王海鵬,鄭冬冬

(蘇州大學附屬第一醫院,蘇州 215006)

技術方法

兔在體心臟缺血再灌注模型的制作方法的改進

薛 楓,楊向軍,李 勛,韓蓮花,王海鵬,鄭冬冬

(蘇州大學附屬第一醫院,蘇州 215006)

目的建立兔在體心臟缺血再灌注模型的新方法。方法40只新西蘭大白兔隨機分為缺血再灌注組(25只),假手術組(15只)。缺血再灌注組采用“二線二結”法結扎心臟左前降支 30 min,然后恢復心肌灌注 3 h;假手術組僅將線從左前降支周圍心肌中穿過,但并不結扎。實驗中連續描記心電圖。兩組分別于結扎 (穿線)前和再灌注 (穿線)后 1 h從股靜脈取血 1 mL測定血清肌鈣蛋白。實驗結束時取心肌行 2,3,5-氯化三苯基四氮唑和蘇木精-伊紅染色。結果缺血再灌注組心電圖存在 ST-T的動態演變,再灌注 1 h后血清肌鈣蛋白濃度明顯高于術前 (0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P=0.002)。兩種染色方法均證明存在心肌壞死。結論“二線二結”法能夠既方便又成功地建立兔在體心臟缺血再灌注模型。

兔;模型,動物;在體心臟;缺血再灌注

當急性心肌梗死發生后,早期成功地運用溶栓治療、經皮冠狀動脈成形術 (PCI)或急診冠狀動脈搭橋術(CABG)可以使心肌得到再灌注,從而減少壞死的心肌面積,改善臨床預后。但是研究發現再灌注會加劇心肌細胞的損傷,導致心肌梗死面積增大,再灌注心律失常和無復流現象的發生[1],從而減少了以上治療所獲得的好處。因此如何能減少再灌注損傷的發生已成為目前研究的熱點,而建立心臟缺血再灌注的動物模型為研究提供了平臺。迄今為止國內外學者已先后以大鼠、兔、犬和豬制作了該模型[2-5],其中大多數為采用心臟灌流裝置的體外模型,少部分為制作繁瑣的心臟在體模型。本文介紹一種簡便的兔在體心臟缺血再灌注模型的制作方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔 40只,雌雄不拘,體重 1.8～3.2 kg,由蘇州大學實驗動物中心提供 [合格證號: SYXK(蘇)2007-0035]。其中缺血再灌注組 25只,假手術組 15只。本研究遵循國家實驗動物管理條例及國家實驗動物管理實施細則。

1.2 實驗耗材

RM6240BO型多道生理信號采集處理系統 (成都儀器廠)。ECG-6511型心電圖儀 (上海光電醫用電子儀器有限公司 )。Eppendorf-5417C型高速離心機(德國艾本德公司)。華利達 HZ-8812S型水浴搖床 (太倉科教器材廠)。Ther mo Scientific Revco超低溫冰箱 (美國賽默飛世爾科技公司)。PH計(德國賽多利斯公司)。手術剪 3把,血管鉗 4把,持針器 1把,5×12圓針 1枚,8×20三角針 1枚,0號及 4號縫線,彎頭鑷 1把,刀片 1把,7號注射器針頭 4個。2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (TTC,Bio Basic Inc.)。3%戊巴比妥鈉溶液。生理鹽水。磷酸鹽緩沖液(25 mg磷酸氫二鈉和 0.5 mg磷酸二氫鈉溶于 2 L三蒸水中,調節 pH 8.5～8.6)。羊抗兔心臟肌鈣蛋白檢測試劑盒(ADL公司)。

1.3 模型制作過程

取兔稱重后用木制兔盒將其固定,經耳緣靜脈緩慢注射 3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg),待四肢松軟、睫毛反射消失后停止注射,將其仰臥固定于手術臺。胸部備皮后予皮膚消毒劑安爾碘消毒,沿胸部前正中線做縱形切口,逐層剖開暴露胸骨及胸廓。于第 2肋間用剪刀剪斷胸骨,并同時將胸骨與第 2～4肋雙側連接處剪斷,除去胸骨后用縫線向兩側牽拉胸廓以擴大手術視野,用眼科小剪刀剪開縱膈胸膜和心包膜暴露心臟。以肺動脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈主干為標志,于左心耳下方2 mm處進針縫線穿過心肌,深度為 2 mm,寬度為4～5 mm,與左冠狀靜脈平行放置一根縫線于心臟表面。予肝素鈉溶液 (500 U/kg)靜脈推注后,將穿過心肌的縫線交叉打一單結并拉緊兩端 (假手術組僅穿線不結扎),由助手將結下放置的與左冠狀靜脈平行的另一根縫線交叉打一活結,通過兩個結成功結扎左前降支。其標志為心電圖 II導 ST段明顯抬高,結扎局部心肌由紅色轉為暗灰色。30 min后解開活結,通過牽拉該縫線解開結扎左前降支的死結,從而恢復該血管的灌注。

1.4 心電圖

將 7號注射器針頭扎入兔四肢皮下作為電極,將多道生理信號采集處理系統和心電圖儀的電極線與其連接,記錄 II導心電圖。

1.5 心肌染色

再灌注 3 h后取出心臟,洗凈血跡,去除心房和右心室。于 -80℃冷凍 0.5 h后沿左室長軸將左室橫切為厚約 2 mm的薄片,將其置于 30 mL 1%TTC溶液 (0.3 g TTC溶于 30 mL磷酸緩沖液)中,于37℃水浴 0.5 h。

1.6 組織形態學觀察

心肌再灌注 3 h后剪取心臟,于冠脈穿線處下5 mm處剪取一小塊左心室前壁,常規石蠟制片,蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微鏡觀察組織形態學變化。

1.7 血清肌鈣蛋白測定

缺血再灌注組分別于結扎前和再灌注 1 h后穿刺股靜脈取血 1 mL,假手術組于穿線前和穿線后 1 h取靜脈血 1 mL。所有血樣均于 2 500 r/min離心10 min取血清于 -80℃保存。收齊標本后按 ADL公司羊抗兔心臟肌鈣蛋白檢測試劑盒說明書操作測定血清肌鈣蛋白。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 心電圖

左前降支結扎后 II導聯 ST段弓背上抬明顯,再灌注后 ST段回落至基線 (圖 1)。

2.2 心肌染色

壞死的心肌呈白色,正常心肌染成磚紅色 (圖2)。

2.3 組織形態學觀察

梗死區心肌喪失正常結構,橫紋消失,細胞水腫,胞核溶解、消失,并可見炎癥細胞浸潤 (圖 3), (圖 2,3見彩插 2)。

2.4 血清肌鈣蛋白測定

再灌注 1 h后左前降支結扎者血清肌鈣蛋白濃度明顯高于術前(0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P= 0.002),而假手術組穿線前后無明顯變化 (0.26± 0.2 vs.0.3±0.15,P=0.08)。

3 討論

目前在體制作心臟缺血再灌注模型的方法有開胸結扎冠狀動脈和不開胸、應用心導管介入方法封堵左前降支。本研究采用前一方法制作了兔在體心肌缺血再灌注模型。與眾多以大鼠為對象的研究相比,兔具有以下優點:⑴作為哺乳動物其心臟生理特性與人類更為相似(6);(2)心臟相對較大便于操作;(3)左右胸腔各自具有獨立的胸膜,互不相通。暴露心臟時不需使用呼吸機。多年以來大多數實驗采取左側第 2、3、4肋間切口開胸。但筆者認為該方法存在較高的氣胸發生率,易導致兔死亡。而胸骨正中開胸減少了這種風險。

開胸結扎兔冠狀動脈通常選擇左前降支,但該血管被薄層心肌覆蓋,肉眼不能明視,且長短不一,最短者只達心室的上 1/3,最長者長達心尖(7)。故結扎部位亦高,通常選擇左心耳尖下方結扎,且進針要有一定深度,結扎時以與左前降支伴行的左冠狀靜脈為標志。有文章報道(8)結扎左室支造模,該血管為左旋支分支,沿心臟左緣下行,其特點為表淺、粗大,供血范圍較大,造模成功率較高。但筆者認為在體模型本身手術視野不大,找尋并結扎左室支難度較大,且如結扎部位偏高則易致兔死亡,故仍推薦結扎左前降支。

缺血再灌注模型不同于心梗模型,結扎血管造成心肌缺血后要迅速恢復血流。目前大多數實驗都是通過將結扎血管的縫線兩端共穿一細管形成閉環,拉緊縫線用止血鉗固定導致心肌缺血,松開鉗子則使心肌得到再灌注(9)。該方法對細管的要求較高,太軟則不能完全阻斷血流,太硬則容易損傷心肌。也有研究者通過剪斷該線來實現再灌注。但由于結扎血管的縫線深陷心肌內,故不僅不能立即恢復血流,而且剪線時容易損傷心肌。本研究所采用的“二線二結”法既簡單又有效。結扎血管的縫線所打單結本身易松動,但由于單結下第二根線所打活結剛好壓在其上方使其其不易松動,從而阻斷血流。當輕松解開該活結后,由于該線恰好位于單結下方故將其向上方牽拉可以立即解開該單結,實現心肌再灌注。血清肌鈣蛋白測定和心肌染色證明該方法確實造成了心肌缺血壞死。兩結均解開后出現的心電圖改變說明該方法成功實現了心肌再灌注?！岸€二結”法目前未見報道,筆者認為值得推廣。

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A NewM ethod to Establish a RabbitM odel of Heart Ischem ia-Reperfusion in Vivo

XUE Feng,YANG Xiang-jun,L IXun,HAN Lian-hua,WANG Hai-peng,ZHENGDong-dong
(The FirstAffiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China)

ObjectiveThis study intended to explore a new method to establish a model of heart ischemiareperfusion in rabbits in vivo。MethodsForty New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups: ischemia-reperfusion group(n=25)and sham operation group(n=15).The myocardial ischemia-reperfusion were generated by two sutures and two knots,namely ligating the prox imal 1/3 segment of the left anterior discending artery (LAD)for 30 minutes followed by opening the blood flow for 3 hours.The LAD of rabbits in the sham operation group was exposed but not ligated.Electrocardiography(ECG)was perfor med during the experiment.Blood sample was drawn from the femoral vein to evaluate cardiac troponin I(cTnI)values before operation and after reperfusion in the ischemiareperfusion group.At the end of the test myocardial tissues were taken and stained with 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride(TTC)and HE,respectively。ResultsThere were electrocardiographic ST-T change in the rabbits of ischemiareperfusion group.The cardiac troponin I values in reperfusion stage were significantly higher than the preoprative values (0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P=0.002).both the two stainingmethods confirmed that there weremyocardial necrosis in this group。Conclusions The new method of two sutures and two knots as described in this study can conveniently and successfully establish a rabbitmodelof heart ischemia-reperfusion in vivo,and provide a useful tool for related experimental researches.

Rabbits;Models;Establishment;Heart;Ischemia-reperfusion

R-33

A

1671-7856(2010)02-0051-03

2009-11-15

薛楓(1972-),女,主治醫師,在讀博士研究生,主要從事心血管疾病的診治。

楊向軍,E-mail:szlongman@126.com。