盾葉薯蕷組培快繁技術(shù)研究

梁艷麗，趙慶云，謝世清

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明，650201）

盾葉薯蕷 （Dioscorea zingiberensisC.H.Wright）是薯蕷科薯蕷屬的一種多年生纏繞性草質(zhì)藤本植物[1]，是重要的藥源植物，其主要有效成分薯蕷皂甙元是合成甾體激素類藥物長效口服避孕藥皮質(zhì)激素及抗休克等藥物的主要原料，國內(nèi)外需求量很大。由于過度采挖，其野生資源已瀕臨枯竭，進行人工栽培是發(fā)展盾葉薯蕷產(chǎn)業(yè)的必由之路[4]。盾葉薯蕷人工栽培主要采用以根狀莖作種的無性繁殖手段。這種繁殖用種量大，繁殖系數(shù)很低，繁殖的速度和數(shù)量難以滿足實際生產(chǎn)需求。加之根狀莖本身即是盾葉薯蕷的經(jīng)濟器官，采用根狀莖繁殖造成盾葉薯蕷繁殖成本居高不下[5]。為加速盾葉薯蕷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，并節(jié)約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對其進行種源快繁是一條有效的途徑[6]。本文通過對外植體的選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的研究，旨在為盾葉薯蕷快繁育苗體系的建立提供一定的技術(shù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魔芋研究所提供的盾葉薯蕷優(yōu)良品系盾薯38。取溫室大棚栽植的植株幼葉、帶節(jié)莖段和根狀莖作為外植體。

1.2 試驗方法

材料取回后，先用清水浸泡15～25 min，用洗衣粉水清洗，再用自來水漂洗，用蒸餾水沖洗3～5次備用。在無菌操作臺上，無菌條件下用75%酒精浸洗30 s，蒸餾水沖洗2次，再用0.1%升汞浸泡3～5 min，蒸餾水清洗4～6次，切成大小適宜的小塊，即可接種。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA。培養(yǎng)基的pH值為5.8，瓊脂濃度為6.5 g/L。培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照條件為每1 m240 W節(jié)能燈管2根，每天光照時間為12～14 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體滅菌效果的比較

從表1可以看出，在相同條件下，不同外植體的污染率存在較大差異，根狀莖的污染率最高，為60%，而莖段的污染率最低，僅為20%，幼葉的污染率介于二者之間。但由于幼葉較為柔嫩，對滅菌藥品的耐受能力較差，滅菌處理后，多數(shù)葉片都出現(xiàn)焦枯現(xiàn)象，死亡率較高，因此，滅菌效果最好的外植體為帶節(jié)莖段。且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，帶節(jié)莖段在接種30 d后，長出的腋芽和不定芽較多，誘導(dǎo)效果明顯好于幼葉和根狀莖，因此帶節(jié)莖段為最佳外植體。在后續(xù)的試驗中，均以帶節(jié)莖段作為外植體進行操作。

2.2 不同濃度的6-BA與不同濃度的NAA配比對盾葉薯蕷莖段芽誘導(dǎo)的影響

本試驗以帶節(jié)莖段作為外植體，設(shè)計了10種培養(yǎng)基對其進行芽誘導(dǎo)。接種5 d后，部分處理在莖切口處即開始顯現(xiàn)綠色，25 d后各處理先后出現(xiàn)不定芽，接種30 d后統(tǒng)計結(jié)果。從表2可以看出，不同的激素以及不同的濃度誘導(dǎo)效果有較大的差異。從1號和2號培養(yǎng)基的比較中可以看出，在6-BA均為2 mg/L時，在培養(yǎng)基中添加NAA有助于誘導(dǎo)成功，誘導(dǎo)率提高了10%。在NAA濃度為0.20 mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率反而呈現(xiàn)下降趨勢，說明高濃度的6-BA并不利于外植體的分化。且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度過高時，芽個體變小，芽色變白，玻璃化現(xiàn)象較為嚴(yán)重。在6-BA濃度均為3 mg/L的情況下，隨著NAA濃度的增加，誘導(dǎo)率有上升的趨勢，但當(dāng)NAA濃度大于0.5 mg/L時，表現(xiàn)出明顯抑制生長的現(xiàn)象，體現(xiàn)了生長素低濃度促進生長，超高濃度抑制生長的特性。從10種培養(yǎng)基的比較中可知，較低濃度的6-BA和適宜濃度的NAA對莖段外植體的芽誘導(dǎo)有明顯的促進作用，其中，以2號培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率最高，達到70%，因此最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L（表 2）。

表1 不同外植體滅菌效果比較

2.3 不同濃度的6-BA與不同濃度的NAA配比對盾葉薯蕷增殖的影響

外植體誘導(dǎo)30 d后，即可進行繼代增殖培養(yǎng)。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上5 d后，均有明顯的增粗和伸長，15 d后有叢生芽出現(xiàn)。轉(zhuǎn)接30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

從表3中可知，參照前序試驗而制定的6種培養(yǎng)基對盾葉薯蕷的增殖效果均較好。6-BA在1～2 mg/L，NAA在0.1～0.3 mg/L的范圍增殖系數(shù)均較高，在3.0～6.0。但不同激素濃度配比對增殖效果的影響還是有所差異的，當(dāng)6-BA濃度為2 mg/L時其平均增殖系數(shù)為5.3，當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L時其平均增殖系數(shù)為3.6，說明適當(dāng)增加6-BA濃度有利于盾葉薯蕷組培苗的增殖。同時，NAA濃度的變化對增殖效果也產(chǎn)生了明顯的影響，當(dāng)6-BA濃度不變時，隨著NAA濃度的增加，出芽數(shù)呈明顯下降趨勢，說明高濃度的NAA會抑制盾葉薯蕷不定芽的產(chǎn)生。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，低濃度的6-BA條件下雖然增殖系數(shù)偏低，芽生長速度較快，易于成苗，但苗較為纖細(xì)；高濃度的6-BA雖然有利于提高增殖系數(shù)，但幼苗生長較慢，出苗時間長，苗更為健壯。綜合以上因素，盾葉薯蕷不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基應(yīng)為4號培養(yǎng)基，其增殖系數(shù)達到6.0。增殖效果最差的培養(yǎng)基為3號培養(yǎng)基，增殖系數(shù)最低，為3.0。因此，最佳增殖繼代培養(yǎng)基應(yīng)為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2 不同激素濃度配比對盾葉薯蕷芽誘導(dǎo)的影響

表3 不同激素濃度配比對盾葉薯蕷組培苗增殖的影響

2.4 不同濃度的NAA對盾葉薯蕷生根的影響

待增殖芽苗高于4 cm時即可進行生根培養(yǎng)。本試驗以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA進行生根培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接10 d后，部分培養(yǎng)基上即有根原基出現(xiàn)。發(fā)根初期，不定根附著于培養(yǎng)基的表面，隨后逐漸深入培養(yǎng)基內(nèi)部，并逐漸形成須根。不同NAA濃度的培養(yǎng)基在組培苗發(fā)根的早遲、生根率等方面均存在較大差異。從表4可以得出，在這6種培養(yǎng)基中，以3號培養(yǎng)基發(fā)根最早，5號和6號培養(yǎng)基發(fā)根最遲。生根株數(shù)也以3號培養(yǎng)基最多，為26株。

隨著NAA濃度的增加，試管苗生根率有所增加，說明NAA的確有誘導(dǎo)生根的良好作用。但當(dāng)NAA濃度高于0.5 mg/L時，生根率呈現(xiàn)迅速下降趨勢。這一規(guī)律說明，NAA只有在適宜濃度的條件下才有利于盾葉薯蕷組培苗的生根。綜合發(fā)根時間、生根率及根系生長情況得知，在參試的6種培養(yǎng)基中，以3號培養(yǎng)基生根效果最好，不僅生根率最高，為87%，且發(fā)根早，根系粗壯，白凈，須根最多。因此，盾葉薯蕷最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

表4 不同NAA濃度對盾葉薯蕷生根的影響

3 討論

3.1 外植體的選擇

在盾葉薯蕷的離體培養(yǎng)中，外植體的選擇非常重要。為了提高誘導(dǎo)率，一般選擇植株的幼嫩部分作為組織培養(yǎng)的外植體[9]。植物組織幼嫩，生命力強，有利于誘導(dǎo)和分化[10]。但幼嫩部分往往對消毒的耐受能力較差，導(dǎo)致棄材率較高，誘導(dǎo)效率不高，如本試驗中的幼葉。本試驗采用相對較成熟的帶節(jié)莖段作為外植體，比用幼葉的誘導(dǎo)效果好，誘導(dǎo)率較高。而根狀莖深埋于土層當(dāng)中，內(nèi)部可能帶有細(xì)菌和病毒，所以導(dǎo)致滅菌不徹底，污染率最高，不適宜作為盾葉薯蕷組培快繁的外植體。

3.2 生根的問題

本試驗最高生根率為87%，最低生根率為20%，與前人的100%的生根率相比有一定差距。生根率偏低可能與在培養(yǎng)基中沒有添加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)有關(guān)。因考慮到細(xì)胞分裂素利于芽的分化，生長素利于根的分化的特點，在培養(yǎng)基設(shè)計時，為了提高培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比值，利于生根，就僅在培養(yǎng)基中加入生長素而沒有添加細(xì)胞分裂素。但細(xì)胞分裂素的缺乏可能導(dǎo)致細(xì)胞分裂受抑制，從而表現(xiàn)為生根率不高。在后續(xù)的試驗中還需進一步考察培養(yǎng)基中添加6-BA對盾葉薯蕷生根的影響。

4 結(jié)論

由試驗結(jié)果可知，在幼葉、莖段和根狀莖的比較中，帶節(jié)莖段是最適宜的外植體。以莖段作為外植體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L。最佳增殖繼代培養(yǎng)基應(yīng)為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。盾葉薯蕷最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

[1]趙慶云，寸湘琴，楊燕，等.云南高原幾個盾葉薯蕷種質(zhì)特征特性及栽培要點[J].種子，2003（1）：41-42.

[2]周謹(jǐn)，李伯剛.藥用薯蕷栽培[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2003：9-10.

[3]王軍，張金蓮，李少峰，等.盾葉薯蕷組織培養(yǎng)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，19（3）：506-509.

[4]董靜洲，易自力，蔣建雄，等.四倍體盾葉薯蕷綜合經(jīng)濟性狀的分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，14（2）：152-154.

[5]謝碧霞，何業(yè)華，易志軍.盾葉薯蕷愈傷組織培養(yǎng)及其高產(chǎn)系的篩選[J].中南林學(xué)院學(xué)報，1999，19（4）：17-21.

[6]Shou Y,Choy N G.In vitro tuberization in white yam(Dioscorea rotundataPoir)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Cultrue,1988,14:121-128.

[7]彭菲，劉軍，肖艷.不同外植體和激素組合對盾葉薯蕷組織培養(yǎng)的影響[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24（6）：12-17.

[8]易志軍.盾葉薯蕷愈傷組織培養(yǎng)研究[J].經(jīng)濟林研究，2001，19（3）：21-22.

[9]Zheng G Z.Plant cell culture and its secondry metabolism[M].London:Longman,1992：83.

[10]張航宇，吳琴生，劉大鈞.藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及其應(yīng)用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，18（4）：25-32.

[11]王新明，彭友林，卓君華，等.特種經(jīng)濟動植物養(yǎng)種實用新技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：244-245.