基于礦石納米材料的DNA轉化的機理初探及方法改進

譚海東，王磊，林金濤，趙宗保

中國科學院大連化學物理研究所生物技術部，大連 116023

微生物的 DNA轉化方法是基因工程中的重要內容，目前對微生物轉化主要有化學法和電轉化法[1]。但這些轉化方法，仍然存在許多缺點，比如感受態細胞準備時間長，處理過程容易導致細胞活性降低，處理后要有溫育等過程。2001年，Yoshida等發表了一系列關于使用溫石棉 (Chrysotile asbestos) 實現質粒對原核生物轉化的有趣方法[2-5]，這種方法被命名為Yoshida效應。但是這種方法仍然有很多缺點：操作繁瑣、利用的介質對人體致癌等。對該法的可靠性有很多質疑，限制了它的應用[6]，所以這種新穎的DNA轉化法很少被其他科學家引用。

最近，這種方法又進一步被Wilharm等改進[6]。他們使用的一種價格便宜、資源豐富、對人類健康友好的礦石納米材料海泡石 (Sepiolite) 作為介質，實現了對多種微生物的質粒轉化。作者在本方法中使用的參數與 Yoshida等報道的一致，并根據后者的報道，提出了借助海泡石進行DNA轉化的相同機制。問題是海泡石和溫石棉屬于不同的介質：前者沒有生物活性，后者有一定的生物活性；前者對人體友好，而后者可以致癌等。因此，我們認為這種新的轉化方法，可能會存在不同的DNA轉化機制。Wilharm 等雖然對方法進行了改進，但該工作是以非常短的通訊形式報道，很多參數未優化。我們認為對這種轉化機制的充分理解和對該試驗參數的優化，會促進這種方法的推廣和實現對特殊物種的DNA轉化。為此，我們進行了本研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌種

pET15b質粒有本組保存。E. coli DH5α菌株購自北京鼎國生物技術有限公司。短乳酸桿菌Lactobacillus brevis AS 1.579購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

蛋白酶K、250 bp DNA marker購自TaKaRa公司大連分公司。200~300 bp的RNA從短乳酸桿菌AS 1.579提取，在本組保存。海泡石購自德國Kremer Pigmente有限公司 (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG，Hauptstr. 41?47DE 88317 Aichstetten，Germany)，產品編號 58945。溶菌酶、鹽酸胍、十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)、苯酚和瓊脂糖購自北京鼎國生物技術有限公司。其他培養基及生化試劑牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、氯仿和異戊醇等均為分析醇，購自大連博諾生物化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 海泡石懸浮液和培養基的準備

海泡石懸浮液根據文獻準備4%儲存液[6]：海泡石121℃滅菌20 min；用去離子水配含200 mmol/L KCl，5 mmol/L HEPES緩沖液，用NaOH調pH到7.4，過膜除菌。最后配成5% (W/V) 海泡石儲存液。另外配10×海泡石緩沖液 (2 mol/L KCl，50 mmol/L HEPES，7.4) 備用。

LB培養基：在950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，搖動容器直至溶解，用NaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1 L。取200 mL，加入3 g瓊脂粉。在120℃滅菌20 min。待溫度降到50℃左右，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，準備40個抗性平板。

MRS培養基的配制：1 L蒸餾水中溶解下列組分：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂 200 mg，硫酸錳50 mg，用高壓鍋在121℃滅菌15 min，調pH到6.8。其中葡萄糖單獨滅菌。

1.2.2 海泡石吸附pET15b試驗及轉化E. coli DH5α的試驗

從于 37℃培養 20 h的新鮮平板中挑取一個E. coli DH5α單菌落，接種于10 mL LB液體培養基中，37℃下振蕩培養過夜。將該菌懸液以1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養基中，37℃振蕩培養3 h至OD600=0.5左右。將培養液轉入離心管中,冰上放置10 min, 然后于4℃下4 000 r/min離心10 min。棄去上清，用預冷的海泡石緩沖液10 mL輕輕懸浮細胞，4℃下4 000 r/min離心10 min。最后用2 mL的海泡石緩沖液懸浮，置于冰上備用。

取40 μL pET15b溶液 (100 ng/μL)，加入10 μL的5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合，取5 μL備用。剩余的溶液12 000 r/min離心30 s，用1 mL的海泡石緩沖液連續洗滌 2次。吸附結果用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

取備用的細胞50 μL，加入5 μL質粒飽和的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%)，充分混合。取備用的細胞50 μL，加入1 μL洗滌后的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%)，充分混合。將2種懸浮液加到2個LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂抹30 s，最后放在37℃培養過夜。

1.2.3 利用海泡石對pET15b轉化E. coli DH5α的試驗參數優化

海泡石緩沖液對DNA轉化率的影響：取備用的細胞50 μL 2份，1份用LB洗滌細胞，另外1份仍然保留海泡石緩沖液。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將2種懸浮液加到2個LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。

細胞濃度對DNA轉化率的影響：分別取備用的細胞500 μL、50 μL和5 μL，前者通過離心后用50 μL海泡石緩沖液懸浮，后者加入45 μL海泡石緩沖液懸浮，這樣 3個樣品的 OD600分別是 200、20和2。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將3種懸浮液加到2個LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。

海泡石的濃度對DNA轉化率的影響：分別取備用的細胞50 μL 3份，分別配成海泡石終濃度為1%，0.1%和0.01%的混合液。分別加入10 ng pET15b充分混合。將3種懸浮液加到3個LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)，立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。

涂板次數和預干處理對DNA轉化率的影響：取備用的細胞50 μL 7份，分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將4份懸浮液加到4個LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板分別均勻涂抹10次、20次、40次和100次，最后放在37℃培養過夜。另外3份細胞，1份立即用玻璃板均勻涂平板30 s，第2份10 min后用玻璃板均勻涂平板30 s，第3份20 min后用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。

1.2.4 利用海泡石對pET15b直接轉化E. coli DH5α單菌落

取4℃存放1個月的E. coli DH5α單菌落，加入20 μL海泡石緩沖液，加入100 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，充分混合。將細胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。

1.2.5 短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取

為了獲得短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA，該加入100 μL 5 mol/L NaCl混勻，再加入80 μL的CTAB/NaCl混勻，65 ℃ 10 min。加入固體的鹽酸胍至終濃度6 mol/L[10]，待細胞徹底裂解后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液 (25∶24∶1)，混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。12 000 r/min離心10 min。沉淀用 75%的乙醇洗滌，晾干，最后用20 μL TE溶解，取3 μL電泳檢測。

1.2.6 小片段RNA對pET15b轉化E. coli DH5α的影響

取1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液，加入5 μL小片段的RNA提取液 (200 ng/μL)，充分混合，讓海泡石飽和吸附RNA。加入10 ng pET15b和備用的細胞50 μL，充分混合。將細胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s，最后放在37℃培養過夜。并與不加小片段RNA的作對照。提取使用不加 RNAase的基因組提取方法，參考分子克隆實驗指南[7]，并對此方法進行優化。簡述如下：取單克隆短乳酸桿菌到10 mL MRS培養基中，200 r/min、37℃培養過夜。將過夜培養物按 1∶50接入 100 mL MRS中，200 r/min、37℃培養至OD600=0.5。10 000 r/min離心30 s，收集沉淀，使用500 mmol/L的EDTA洗滌3次，最后用2 mL的500 mmol/L EDTA懸浮，200 W微波處理1 min[8-9]。10 000 r/min離心30 s收集沉淀，取50 mg菌體用400 μL TE重懸于1.5 mL離心管中，加入終濃度為10 mg/mL溶菌酶，10 mmol/L的DTT，37℃保溫1 h。加入50 μL蛋白酶K (10 mg/mL)，混勻，65℃，1 h。

2 結果

2.1 海泡石吸附pET15b試驗

從圖1可以看出，用pET15b飽和后的海泡石，經過海泡石緩沖液充分洗滌后的海泡石幾乎檢測不到DNA。此結果說明海泡石對質粒的pET15b吸附能力很弱，幾乎看不到DNA吸附。用pET15b飽和的海泡石轉化細胞，長出的克隆數遠遠高于洗滌后的海泡石轉化數 (圖2，16-17)。這些結果說明，利用海泡石實現質粒轉化，有可能不是海泡石將DNA帶入宿主內的，而是由海泡石在宿主表面產生的瞬間小孔，導致DNA的隨機進入。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測海泡石吸附pET15b能力Fig. 1 Analysis of 1% agarose electrophoresis for the ability of sepiolite absorbing pET15b. 1: pET15b; 2: the sepiolite absorbing pET15b saturatedly; 3: the sepiolite saturated with DNA was washed once; 4: the sepiolite saturated with DNA was washed two times.

圖2 海泡石用于E. coli DH5αDNA轉化的參數優化Fig. 2 Optimization of DNA transformation for E. coli DH5α based on sepiolite. 1?2: the effect of sepiolite buffer for transformation. 3?5: the cell concentration is OD600=200, 20 and 2 in sample 3, 4 and 5 respectively. 6?8: the percent content of sepiolite is 1%, 0.1% and 0.01% in sample 6, 7 and 8 respectively; 9?12: the circulating times are 10, 20, 40 and 100 in sample 9, 10, 11 and 12 respectively. 13?15: the pre-dry treatment is 0 min, 10 min and 20 min in sample 13, 14 and 15 respectively; 16?17: washing effect for transformation; 18?19: the effect of RNA treatment for transformation.

2.2 利用海泡石對pET15b轉化E. coli DH5α的試驗參數優化

2.2.1 緩沖液

試驗結果表明，使用培養基轉化率略高于使用海泡石緩沖液 (圖2，1~2)。另外海泡石緩沖液配制和過膜除菌的操作繁瑣，利用培養基懸浮細胞，將使轉化變得更加直接。

2.2.2 細胞濃度

細胞濃度是決定轉化率高低的重要參數，我們研究表明當細胞濃度在OD600=20時轉化率最高 (圖2，3~5)。不同于電轉，細胞濃度越高轉化率越高。這可能與海泡石物理運動空間需要有關，細胞濃度太高，海泡石纖維不能充分運動，限制了質粒對細胞的有效轉化。

2.2.3 海泡石濃度

試驗結果表明使用海泡石的濃度比報道的高了近10倍，而轉化率有5倍以上增加 (圖2，6~8)。我們認為使用0.1%的海泡石濃度，而不是0.01%，轉化率會更高些。具體原因不很清楚，是否由于不同批次產品之間存在納米纖維材料數量的差異。

2.2.4 涂平板次數和狀態

菌液不經預干處理，直接涂抹平板，隨著涂抹次數的增加，轉化率逐漸增加 (圖2，9~12)。另外，隨著預干處理時間的延長，轉化率會逐漸降低 (圖2，13~15)。

2.3 利用海泡石對pET15b直接轉化E. coli DH5α單菌落

在 4℃儲存 1個月的單菌落，利用海泡石仍然可以實現質粒的轉化。取 4℃儲存 1個月的單菌落，利用海泡石直接轉化，轉化率低于 100/μg pET15b。但是，該操作大大節省了時間，不需要轉化前的再培養，沒有感受態制備或超低溫凍存和轉化后的溫育等過程。同時單菌落的直接轉化，由于菌量過少，通過鈣轉和電轉難以實現。當然，本操作不適用于對轉化率要求非常高的實驗，但可以在條件非常落后的實驗室中普及。該操作也可用于某些特殊的實驗，比如某些致病菌對抗性質粒的易感染性等。

2.4 短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取

為了得到理想化的RNA小片段，采取基因組提取方法得到降解的RNA片段。經過該試驗，可以從短乳酸桿菌得到理想的小片段RNA：濃度較高，大于200 ng/μL；分子量在300 bp左右 (圖3)，根據文獻報道，非常適合用于海泡石上 DNA競爭結合試驗。同時，我們也嘗試了其他微生物的RNA提取，但是得到的RNA總是一條模糊的帶，分子量集中在500 bp和2 kb之間，不符合本試驗的需要。對這種結果的差異，無法從試驗過程中得知。

圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取Fig. 3 Analysis of 1% agarose for small RNA extraction from Lactobacillus brevis AS1.579. M: marker; 1: small RNA.

2.5 小片段RNA對pET15b轉化E. coli DH5α的影響

經小片段RNA飽和的海泡石轉化E. coli DH5α，與對照組相比，幾乎沒有什么變化 (圖2，18~19)。同樣說明，利用海泡石實現質粒轉化，有可能不是海泡石帶 DNA進入宿主內，而是由海泡石在宿主表面產生的瞬間小孔，導致外源DNA的隨機進入。

3 討論

利用海泡石轉化有以下優點：可以實現質粒對細胞的轉化；這種介質對人體健康友好，無致癌物質；本身無生物活性，不會對宿主生長產生影響；操作過程中不需特殊的設備；不需要感受態的制備就可以得到較高的轉化率；另外，資源豐富、價格便宜，使這種轉化方法容易推廣。

但是，關于基于礦石海泡石納米材料的 DNA轉化機制仍然不很清楚。Yoshida等利用溫石棉進行DNA試驗，提出競爭機制，即海泡石溫石棉大量吸附DNA，借助涂平板的機械摩擦力，纖維絲插入宿主內。宿主內的RNA與海泡石溫石棉上的DNA競爭，從而實現外源基因對原核生物的轉化[6,11]。Wilharm等對此方法進行了改進，采用無生物活性，對人環境友好的海泡石進行了DNA轉化。但他們提出的轉化機制仍然與 Yoshida等報道的相同。而我們試驗表明海泡石吸附DNA的能力不是很強，洗滌后，轉化率大大降低。而用RNA飽和后的海泡石，轉化率幾乎沒有降低，這些結果說明，海泡石的作用是借助一種瞬間機械力，在細胞膜上擊出孔，借此外源 DNA隨即進入細胞。這種開孔現象是可逆的，移開海泡石，細胞膜會自動修復，將開孔重新封閉。細胞的這一特性，可使一些細胞外源DNA轉入細胞內，從而達到復制或表達的目的。另外，由于對DNA轉化機制理解的不同，導致操作方法有差異。Wilharm等根據他們提出的機制認為，在涂平板前要經過預干處理[6]。根據我們對該機制的理解，預干處理對提高DNA轉化率不利。不經預干過程，用玻璃棒立即涂平板，轉化率較高。而對照組，隨著預干處理時間的延長，轉化率會逐漸降低 (圖2，樣品13~15)。

在重新了解這種基于礦石納米材料微生物轉化機制基礎上，我們對該轉化進行了優化：使用對數生長初期的細胞為宿主，細胞濃度 OD600在 10~20之間，海泡石的濃度為0.1%，不經預干過程，不需要特定的緩沖液，持續涂平板時間在1 min以上，可以實現較高的轉化率，有時高于鈣轉。這些不同于最近的報道[6]，但我們的轉化方法變得更直接，轉化時間變得更短。由于我們使用轉化率較低的pET15b作為實驗對象，說明這種方法可以用于多種質粒的轉化。使用其他質粒如pUC18等可以得到大于1×106/μg質粒的轉化率。這種轉化方法適用于雙鏈環狀DNA (質粒)，線型DNA和其他微生物的轉化有待摸索。

當然這種轉化方法與電轉的轉化率還有很大差距，不同的人操作，會有較大的差異。但該方法無需感受態的制備、不需要貴重的儀器、甚至單菌落冷藏 1個月都可以直接實現轉化，所以這種方法的簡便性會得到很多研究者的青睞。海泡石用于微生物的DNA轉化屬于一種非常新的轉化方法，而且提升的空間很高。在我們的試驗中發現將DNA與E. coli DH5α在微型離心管內混合，槍頭的隨機抽動就可以實現DNA的轉化，該現象預示可以通過海泡石、DNA和微生物的共培養就可以實現DNA的轉化，這為研究特種微生物的DNA轉化提供很新的方法。另外，海泡石可以用于革蘭氏陽性菌的轉化[1]。但該方法用于真核生物的DNA轉化還沒有報道，根據現有的轉化機制推理，這種方法應該很快被用于真核生物的轉化。

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