基于比較基因組學重構細菌的代謝途徑和調控網絡

楊琛

上海生命科學研究院植物生理生態研究所 中國科學院合成生物學重點實驗室，上海 200032

基于比較基因組學重構細菌的代謝途徑和調控網絡

楊琛

上海生命科學研究院植物生理生態研究所 中國科學院合成生物學重點實驗室，上海 200032

微生物基因組學的迅速發展為從功能基因與蛋白、網絡及其調控等不同的角度，全面理解與認識微生物的代謝過程、構建細胞工廠，提供了豐富的背景信息?；诨蚪M序列進行代謝網絡重構，有助于發現新的代謝功能基因、調控元件、甚至新的代謝途徑，從而優化設計細胞內從原料到產品的生物合成路線。然而，目前公共數據庫平臺中代謝途徑基因的功能注釋，許多是錯誤或不完整的。以下著重介紹了近年來出現的一些用于代謝途徑和調控網絡重構的新型比較基因組學技術，并以近期的丙酮丁醇梭菌中木糖代謝途徑的重構工作為例來說明其應用。

比較基因組學，代謝途徑重構，調控網絡重構，基因組上下文分析

隨著FASTA和BLAST等搜索工具的發展、及一些公共數據庫平臺 (如 GenBank、Swiss-Prot等)的不斷完善，基于序列同源比對來推斷基因功能是當前普遍使用的基因組注釋方法[3]。一些模式微生物 (如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、釀酒酵母等) 的功能基因組學研究的不斷深入發展也為此做出了重要貢獻。雖然序列同源比對的方法在很多時候是成功的，但是在一些情況下 (如被非同源基因所取代時)這種方法不能推測基因的功能，或只能給出不準確甚至錯誤的功能注釋。這種情況給基于基因組序列的代謝網絡重構造成了困難。由于單純基于序列相似性的方法存在著局限性，近年來出現了一些比較基因組學的新技術，通過盡量發掘、綜合基因組中蘊藏的相關重要信息，如基因簇[4]、調節位點共享[5]等，以準確預測基因的功能，有效解決缺失基因問題 (Missing genes，即代謝元件應該存在卻還沒有找到對應基因)[2]；在此基礎上，設計實驗以驗證重要的基因功能預測，最終實現代謝網絡的重構。這種有機結合濕實驗 (Wet experiment，指通常的實驗室實驗) 與干實驗 (Dry experiment，指生物信息學分析) 的方法，一方面通過實驗驗證使基因的功能分析更加準確可靠；另一方面能夠大大減輕實驗工作量、提高工作效率。不少研究表明，使用這種方法，能夠顯著提高基因功能注釋和代謝網絡重構的質量，并且發現新的功能基因[6-8]、甚至新的代謝途徑[9-11]。

本文將對用于代謝途徑和調控網絡重構的若干新型比較基因組學技術進行介紹，并舉例說明它們的應用。本文的主要目的之一是鼓勵實驗工作者利用這些技術來解決所感興趣的代謝途徑中存在的缺失基因問題，發現新的代謝功能基因和調控元件，從而加強對代謝過程的理解和應用。

1 代謝途徑和調控網絡重構的比較基因組學技術

1.1 代謝途徑重構

基于微生物基因組的信息解析代謝網絡，識別和表征底物利用與產物合成的關鍵功能基因和蛋白，是進行代謝途徑優化和改造的基礎。雖然目前一些公共數據庫平臺 (如KEGG http://www.genome. jp/kegg/等) 已經注釋了不少代謝基因，包括結構基因和調節基因，但是由于這些數據庫往往僅根據序列同源性來推斷基因的功能，因此存在著許多問題。例如許多梭菌 (如丙酮丁醇梭菌等) 的木糖代謝途徑在KEGG中的注釋是不完整的，甚至存在著相當多的錯誤。造成這種情況的原因是在生物轉化過程中起重要作用的反應酶 (如糖激酶) 往往存在多個同源蛋白，它們在不同微生物中可能具有不同的生理功能，服務于不同的代謝過程，因此如果僅僅基于序列同源比對，就只能給出不準確或不完整的基因功能注釋。此外，已有研究表明，即使與模式菌親緣關系相近的種類，它們的代謝途徑也常常存在著不同，如不同的營養物質攝入機制[12]、反應酶被非同源蛋白所取代[7]等，在這些情況下序列對比的方法就不能推測出基因的功能。針對這些問題，近年來出現了基因組上下文分析方法 (Genome context analysis)，通過盡量發掘、綜合基因組中蘊藏的相關重要信息，以準確預測基因的功能[2,13]，并且通過實驗加以驗證，有效解決缺失基因問題，實現代謝途徑的重構 (圖 1)。以下將對代謝途徑重構的各個步驟進行說明。

1.1.1 代謝途徑的初步構建

基于微生物的完全基因組序列信息，利用SEED (http://theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi)、KEGG等公共數據庫平臺，在先驗知識框架下初步構建代謝途徑。系統地分析所涉及的各個酶、轉運蛋白和調控蛋白，找到對應的編碼基因；根據一條途徑上各步反應的連續性，發現那些理應存在的代謝元件、但尚未找到對應基因的缺失基因問題。SEED中包含大量經專家分析注釋過的代謝途徑數據庫，覆蓋了大部分的微生物代謝網絡，如包括枯草芽胞桿菌等模式微生物中幾乎所有的生化和運輸反應，此外還提供了一個基因組功能注釋和分析的良好平臺。

1.1.2 預測基因功能、填補代謝途徑缺口

利用基因組上下文分析方法，結合基因簇[4,14-15]、結構域融合[16-17]、基因系統發育譜[18]以及調節位點共享[5,19]等多種重要的基因組信息，推斷有關基因的功能關聯性，進而準確預測基因的功能，有效地解決缺失基因問題、填補途徑缺口，重構出完整的代謝途徑 (圖2)。

圖1 基于比較基因組學重構代謝途徑和調控網絡Fig. 1 Comparative genomic reconstruction of regulatory and metabolic networks.

圖2 基因組上下文分析技術Fig. 2 Techniques of genome context analysis.

基因簇——由于原核微生物染色體上功能相關的基因往往會聚集在一起，基因簇是推測不同基因功能耦合的重要依據。

結構域融合 (Protein fusion)——一個微生物中的兩個不同基因在另一個微生物中融合成一個基因，預示著基因的功能相關。

基因系統發育譜 (Phylogenetic profiling)——基于同一個代謝途徑上的基因在不同微生物中往往會同時存在或同時缺失，考察多個基因組上的基因存在規律可以提供功能耦合的依據。

調節位點共享 (Shared regulatory sites)——分析基因上游的調控區序列 (具體方法見1.2)，找出共享調節位點的所有基因，即被一個調控因子所控制、同屬一個調節單元 (Regulon) 的基因?；虻墓舱{節是推測不同基因功能關聯的重要依據。

對于上述比較基因組學研究產生的重要功能預測 (如新的功能基因)，將用實驗來加以驗證。

1.2 調節單元 (Regulon) 重構

長期進化的結果使得微生物的代謝功能具有為自身服務的本能，其代謝過程處于最經濟的狀態，一般不會過量積累不必要的代謝產物。同時微生物能夠根據外界環境條件的改變對自身的生理和代謝功能進行適當調整，以適應環境的變化。這種控制是在轉錄水平、翻譯水平和酶活性等不同層面上調節的復雜過程，構成了一個精密的分子調控網絡。細胞工廠要求微生物細胞能夠定向、高效地生產人類所需要的目標化合物，這就必須去有目的地干擾、改變微生物原有的調控體系。如果不了解代謝途徑的分子調控機制，就難以實現對細胞功能的理性調節。

細菌主要通過在轉錄水平和翻譯水平上進行調節、改變相關基因的表達來適應外界環境的變化。其中轉錄因子 (包括全局調控因子和途徑特異性調控因子) 具有非常重要的作用，它們通過特異性地結合順式調控DNA序列 (轉錄因子結合位點) 來激活或抑制基因的轉錄過程。此外細菌中還有各種RNA調節系統 (如核開關 Riboswitch) 控制基因的表達。隨著大量的原核微生物的基因組得以破譯，基于這些序列信息利用比較基因組學技術預測順式調節元件 (轉錄因子結合位點和 RNA元件)，使得我們可以重構各個調節單元，即由一個轉錄因子或調節RNA調控的所有操縱子，在此基礎上進而構建細胞內的轉錄調控網絡[5]。這將為基因功能預測提供重要證據 (見1.1)，同時將闡明對代謝途徑起重要調控作用的轉錄因子以及代謝物和轉錄因子之間、不同轉錄因子之間的相互作用關系，從而顯著提高對代謝調控的理解和認識，指導以基因操作來調控代謝途徑及代謝功能。

然而，一個轉錄因子在不同基因上的結合位點具有一定的保守性，又不完全相同，這給識別轉錄因子結合位點 (Transcription factor-binding sites) 的工作帶來了困難，使得預測結果普遍存在假陽性率偏高的問題。近年來出現了一些比較基因組學的新技術，通過發掘、分析基因的上游調控區序列，可以準確預測轉錄因子結合位點，實現調節單元的重構[5,20-22]。以下將對調節單元重構的各個步驟進行說明。

1.2.1 轉錄因子結合位點模型的建立

對于某一轉錄因子，分析哪些基因組上含有其編碼基因；根據模式菌中受該轉錄因子調控的靶基因的信息，在一定進化距離內、并且含有該轉錄因子基因的一組基因組中找出靶基因的同源基因；結合代謝途徑重構的結果 (見1.1)，獲得這些基因在基因組上的分布情況。分析這些基因集合的上游調控區序列，找出在多個基因上游出現的DNA回文序列或者串聯的重復序列，即是可能的轉錄因子結合位點；選取信息容量最大的一組DNA序列，即其與轉錄因子結合的概率最大，構建其位置權重矩陣模型(Position weight matrix)[20]。

1.2.2 轉錄因子結合位點的識別、調節單元的重構

利用獲得的位置權重矩陣模型在全基因組范圍內進行搜索，找出更多的該轉錄因子的結合位點，獲得相應的靶基因信息。在多物種間比較獲得的靶基因，利用系統發育足跡分析法 (Phylogenetic footprinting) 去除其中的假陽性結果。這種方法是基于轉錄因子結合位點在進化上相對保守的基本假設，即由于轉錄因子結合位點有調控功能，在進化速度上要慢于其他沒有功能的非編碼序列[5,23]。通過有機結合“共調控”和“進化上保守”這兩種信息，能夠大幅提高轉錄因子結合位點和靶基因預測的準確性。這樣獲得在各個微生物中該轉錄因子所調控的基因集合，即調節單元。

對于上述比較基因組學研究產生的重要功能預測 (如新的轉錄因子與 DNA特異性結合序列)，將用實驗來加以驗證。

1.3 實驗驗證

上述的比較基因組學研究將產生一組代謝途徑上基因功能的預測，包括新的功能基因 (如酶、轉運蛋白、調控蛋白的編碼基因) 以及新的調控元件(如轉錄因子特異性結合的DNA序列)。這些基因功能預測可以通過傳統的或高通量的實驗技術來加以驗證。

對于酶或轉運蛋白等功能預測，可以通過傳統的基因功能鑒定方法來進行驗證。例如，對編碼基因進行敲除，研究關鍵酶活性或轉運能力對代謝功能的影響，分析該基因的生理學功能；考察功能基因能否在相應的模式菌突變株中實現功能互補，即該基因的表達能否使模式菌突變株缺失的功能得以恢復；提取粗酶液，或者分離純化關鍵酶，測定相應的酶活性，分析該酶的生化學功能。

對于轉錄因子或調控元件等功能預測，可以通過傳統的或高通量的實驗技術來加以驗證。例如，對轉錄因子的編碼基因進行敲除，研究該轉錄因子的缺失對重要靶基因轉錄水平的影響；利用融合蛋白報告系統 (Reporter fusion) 分析轉錄因子在體內對靶基因調控區序列的作用；利用凝膠遷移率(Electrophoretic mobility shifts) 或DNase I足跡法(DNase I footprinting) 實驗確認轉錄因子與預測的轉錄因子結合位點的結合情況。近年來也出現了一些高通量的轉錄組和蛋白質組的分析方法，如染色質免疫沉淀技術與基因芯片相結合的 ChIP-on-chip技術被越來越廣泛地用于研究在全基因組上的轉錄因子結合位點[24]。

2 應用舉例：丙酮丁醇梭菌中木糖代謝途徑的重構

丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum是丁醇發酵工業的主要生產菌株，也是產溶劑梭菌研究中的模式菌。該菌能夠利用木質纖維素中最主要的五碳糖——木糖，然而對于哪些基因編碼木糖途徑的關鍵酶和轉運蛋白、以及這些基因表達的調控機制，目前還不清楚，從而難以通過代謝工程改造來提高丙酮丁醇梭菌的木糖代謝能力。

細菌中木糖的代謝大多是在木糖異構酶和木酮糖激酶的作用下生成5-磷酸-木酮糖，進入磷酸戊糖途徑 (Pentose phosphate pathway)。然而，通過同源序列比對的方法在丙酮丁醇梭菌 ATCC824的基因組上無法找到編碼木糖異構酶的同源基因，而且存在若干個編碼木酮糖激酶的同源基因，同時丙酮丁醇梭菌中木糖代謝途徑的調控機制仍不清楚。

針對上述問題，我們利用比較基因組學方法分析了梭菌綱和芽胞桿菌綱微生物的基因組序列信息，重構了它們的木糖和木寡聚糖利用的代謝途徑和調節單元 (圖 3)[25]。通過分析基因簇和調節位點共享，我們發現在丙酮丁醇梭菌及其他一些梭菌中存在一個新的編碼木糖異構酶的基因，其與目前已知的木糖異構酶編碼基因不具備同源性；預測了木糖代謝途徑上的其他基因，包括編碼木酮糖激酶、木糖轉運蛋白、木糖調控因子的基因、以及木寡聚糖利用相關的基因。這些基因功能預測通過分子生物學和生物化學的實驗技術在丙酮丁醇梭菌中進行了驗證。此外，通過基因調控區域序列的比較分析，重構了木糖調控因子的調節單元，發現丙酮丁醇梭菌及其他一些梭菌中具有新的特異性結合木糖調控因子的DNA序列，其不同于目前已知的枯草芽胞桿菌中的木糖調控因子 DNA結合序列,該預測已通過實驗得以證實。

3 結論與展望

本文對用于代謝途徑和調控網絡重構的一些新型比較基因組學技術進行了介紹，并舉例說明了它們的應用。運用這些技術能夠有效地解決缺失基因問題、準確地預測基因的功能，為實驗分析提供指導，從而大大減輕實驗工作量，提高工作效率。文中引用的一些成功實例表明，將這些新型比較基因組學技術與濕實驗進行有機結合，能夠顯著提高基因功能注釋和代謝網絡重構的質量，并且發現新的代謝功能基因、調控元件、甚至新的代謝途徑。本文的主要目的之一是希望實驗工作者能夠從這些成功范例中了解這類新型比較基因組學技術的重要性，從而利用這些技術來解決所關心的代謝途徑中存在的缺失基因問題。

圖3 厚壁菌門細菌木糖代謝途徑的重構. (A) 木糖和木寡聚糖代謝相關基因的分布及特點；“+”表示基因存在；相同背景顏色表示基因在染色體上成簇存在；圓圈表示基因上游有轉錄因子XylR的DNA結合位點；(B) 基因組上下文分析；相同顏色的箭頭表示同源基因；紅色圓圈表示XylR的DNA結合位點；(C) 丙酮丁醇梭菌和枯草芽孢桿菌中的XylR特異性結合DNA序列Fig. 3 Reconstruction of xylose utilization pathway and regulons in Firmicutes. (A) Occurrence and features of genes involved in xylose and xyloside utilization pathway. The presence of genes for the respective functional roles is shown by “+”. Genes clustered on the chromosome are marked by the same background color. Candidate XylR regulon members are circled. (B) Genomic context analysis. Homologous genes are marked by matching colors. Candidate regulatory sites of XylR are shown by red circles. (C) DNA recognition motifs of XylR from Clostridium acetobutylicum and Bacillus subtilis.

隨著多種原核生物的全基因序列得以破譯，這些大量的信息為基因組上下文分析技術的應用提供了很好的數據背景。用于分析的基因組的數目和多樣性往往決定了這些技術能否得以成功應用。例如，在一組非常相近的基因組上 (如同一種類的不同菌株) 基因間的序列往往也是相同的，那么這些基因組就不能用于轉錄因子結合位點的預測分析；另一方面，如果用于分析的微生物的親緣關系相差很遠(如革蘭氏陽性厚壁菌門細菌和革蘭氏陰性變形菌門細菌)，調控元件在這些基因組上并不保守，那么也很難得到準確的轉錄因子結合位點模型。雖然基因簇、調節位點共享和基因系統發育譜分析只適用于原核生物的基因組，但是大量的原核生物基因組信息顯示，大多數的真核生物中代謝酶都可以在一組原核生物中找到功能對等的蛋白質。因此，這些新型比較基因組學技術也將間接地為真核生物基因組以及元基因組數據的準確功能注釋提供重要的幫助。

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Comparative genomic reconstruction of regulatory and metabolic networks in bacteria

Chen Yang
Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China

A large and growing number of complete genomes from diverse species open tremendous opportunities for getting deep insights into cell metabolism. This increased understanding strongly supports engineering of cell metabolism for microbial production. In spite of the recent progress, a large fraction of genes in most of the available genomes remain incorrectly or imprecisely annotated. In this paper we review some of the new comparative genomics techniques used to reconstruct regulatory and metabolic networks from genomic data, reveal gaps in current knowledge, and identify previously uncharacterized genes. The application will be discussed by using a recent example–reconstruction of xylose utilization pathway in Clostridium acetobutylicum.

comparative genomics, reconstruction of metabolic pathways, reconstruction of transcriptional regulatory networks, genome context analysis

自上個世紀末以來微生物基因組學的發展突飛猛進，迄今為止國際上已經公布了超過 1 000組完整的原核微生物基因組序列 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genomes/lproks.cgi)。這為從功能基因與蛋白、網絡及其調控等不同的角度，全面理解與認識微生物的代謝過程、構建細胞工廠，提供了豐富的背景信息[1]。基于基因組序列進行代謝網絡重構，不僅能夠發掘模式菌的新的代謝特性，而且能夠預測我們了解甚少的某些微生物的代謝潛能，發現新的代謝功能基因、調控元件、以及新的代謝途徑[2]。這些都有助于我們優化設計細胞內從原料到產品的生物合成路線，重新組裝部分代謝和調控元件，進而構建具有定向的轉化和合成能力的細胞工廠。

June 4, 2010; Accepted: August 11, 2010

Supported by:One-hundred People Program of Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-YW-G-029), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707802).

Chen Yang. Tel: +86-21-54924152; E-mail: chenyang@sibs.ac.cn

中國科學院項目百人計劃 (No. KSCX2-YW-G-029)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707802) 資助。