Protex 7L中性蛋白酶改性大豆分離蛋白的工藝研究*

楊春華，張毅方，石彥國，章振東

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，哈爾濱150076； 2.哈高科大豆食品有限責任公司，哈爾濱150078）

大豆蛋白因其具有較高的營養價值及改善質構的能力，而在食品加工中應用廣泛。通常，大豆蛋白由90%的球蛋白質組成，主要成分為11S及7S，分別占大豆蛋白的40%及27%。11S是一種分子量大約為35kDa的大豆球蛋白，由6個亞基組成，其酸性亞基及堿性亞基由二硫鍵連接；7S是由三個亞基通過非共價鍵組成的三聚鏈。7S具有較好的溶解性和乳化性，11S具有較好的凝膠性，但其分散性不好，而分散性的強弱直接影響了大豆蛋白在食品加工中的應用。因此，本文試圖對大豆分離蛋白進行改性進而提高其分散性。

蛋白質改性是人為地對蛋白質結構進行修飾，從而改善產品的功能性，目前常用的蛋白改性方法主要有化學法、酶法等等。其中，化學方法改性的副產物非常復雜、不易去除且反應不易控制。而酶法改性正好彌補了這方面的缺陷。實踐表明，酶改性是改善大豆蛋白功能特性的一個有效手段。中性蛋白酶Protex7L是一種從非基因改良的淀粉芽孢桿菌受控發酵提取的細菌中性蛋白酶制劑，該酶能夠在中性條件下水解較寬范圍的底物，它特別適合應用于不能改變pH的蛋白質水解反應中。本文以大豆分離蛋白為原料，采用中性蛋白酶Protex 7L對其進行酶解，試圖揭示酶解條件對大豆蛋白功能特性的影響，探索出一條適合于工業化生產的專用型大豆分離蛋白加工工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

大豆分離蛋白：黑龍江哈高科大豆食品有限責任公司；

Protex7L中性蛋白酶：無錫杰能科試劑公司；

NaOH：分析純，天津市大陸化學試劑廠。

1.2 主要儀器

DZKW-4電熱恒溫水浴鍋：黃驛市渤海電器廠；

PB-20pH計：德國SARTORIUS；

2300 KAU蛋白儀：瑞典FOSS；

分離機：BECKMEN；

BSZ10S電子天平：德國SARTORIUS；

HZQ-C空氣振蕩器：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；

CJJ-781型磁力攪拌器：金壇市望華科教儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆蛋白中蛋白質含量測定 凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）。

1.3.2 水解度（DH值）測定方法 采用pH-stat法。

B：消耗堿量；

N：NaOH摩爾濃度；

α：大豆蛋白氨基的平均解離度，當pH值為7時，α=0.44；

m：水解液中蛋白質的總質量；

h：每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數，對于大豆蛋白h=7.75。

1.3.3 分散性評價 本實驗采用蛋白質分散指數PDI(Protein Disperse Index)作為評價大豆分離蛋白分散性的指標。

1.3.4 Protex7L酶解大豆蛋白的試驗設計

1.3.4.1 加酶量對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應溫度為50℃，反應時間為1h，pH值為7.0，加酶量分別為3.364AU/g SPI、6.728AU/g SPI、13.456AU/g SPI、26.912AU/g SPI、53.824AU/gSPI，以水解度和分散性為指標，探討加酶量對酶解反應的影響。

1.3.4.2 底物濃度對大豆分離蛋白酶解的影響 按加酶量為13.456AU/g SPI，反應溫度為50℃，反應時間為1h，pH值為7.0，底物濃度為9%、10%、11%、12%、13%，以水解度和分散性為指標，探討底物濃度對酶解反應的影響。

1.3.4.3 反應溫度對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應時間為1h，pH值為7.0，加酶量為13.456AU/g SPI，反應溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以水解度和分散性為指標，探討反應溫度對酶解反應的影響。

1.3.4.4 pH值對大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應溫度分別50℃，反應時間為1h，加酶量為13.456AU/g SPI，pH值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，以水解度和分散性為指標，探討pH值對酶解反應的影響。

2 結果及討論

2.1 加酶量對大豆蛋白酶解的影響

加酶量對大豆蛋白酶解程度的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對大豆蛋白酶解程度的影響

從圖1可以看出，大豆蛋白酶解程度與加酶量呈正相關，但從水解度指標來看，隨著加酶量的增加，水解速率逐漸下降，DH值及PDI值上升速率趨緩。原因有二方面，一方面大豆蛋白的整個酶解過程是一個溶質的擴散過程，圖中過程開始時，曲線較陡，擴散速度較快，表明顆粒表面的可溶性蛋白較易擴散到溶液中去，隨著反應進行，顆粒表面的可溶性蛋白消耗殆盡，此時主要的擴散方式是由顆粒內部的可溶性蛋白向外擴散，其速率遠小于表面擴散速率，反映在曲線上，曲線逐漸趨緩；另一方面，酶解過程也是一個水解肽鏈的過程，剛開始酶解過程，隨著肽鏈不斷水解，不斷暴露出新的氨基，羧基等親水基團，因此產物在水中的分散溶解性迅速增加，隨著時間的延長，蛋白酶可水解的肽鍵減少，即使增加酶量，酶解速率亦趨緩?？紤]到成本因素及酶解反應情況，選用加酶量為13.5AU/gSPI較為適宜。

2.2 底物濃度對酶解程度的影響

底物濃度對大豆蛋白酶解的影響實驗結果如圖2所示。

圖2 底物濃度對水解度的影響

由圖2可見，隨著底物濃度增加，水解度和分散性逐漸降低。這是由于底物濃度過高，溶液粘性增加，變成凝膠狀，體系流動性較差，不利于蛋白質的充分溶解和分散，降低了酶與底物的接觸機會；底物濃度不僅影響DH值和PDI值，而且直接決定了大豆蛋白的產量和生產成本，生產中應盡量提高底物濃度。綜合考慮，確定底物濃度為10%為適宜的底物濃度。

2.3 反應溫度對酶解反應的影響

結果如圖3所示。

圖3 反應溫度對水解度的影響

由圖3可見，溫度對水解度的影響非常顯著。當溫度從40℃升高到55℃時，水解度從1.13%陡然增加到1.71%；而當溫度繼續升高時，水解度卻隨之降低。這種影響是因為溫度升高可使酶促反應加快，但在較高的溫度時，酶失活速率也加快。大豆分離蛋白的分散性呈隨溫度先升高后降低的趨勢，在55℃時達到最高。這是因為蛋白質溶液通常表現為非牛頓流體性質，加熱能加劇蛋白質分子的運動，從而加劇蛋白質分子的擴散。蛋白質在溶解時必需破壞蛋白質之間的相互作用，而加熱可使蛋白質分子間和分子內的二硫鍵斷裂，亞基伸展，分散性提高；但另一方面，過高的反應溫度，反應速度并沒有繼續加快，反而下降。這是因為酶分子吸收了過多的能量，引起了維持酶分子結構次級鍵解體，導致酶蛋白變性，使得酶活力減弱。故確定最佳反應溫度為55℃。

2.4 pH值對大豆蛋白酶解反應的影響

結果如圖4所示。

圖4 pH值對水解度的影響

從圖4可見，pH值為7時水解度已接近最大值，繼續調高pH值，對水解度影響不大，但若超過一定值，可能引起蛋白酶失活。這是由于酶作為一種特殊的蛋白質分子，其催化反應的能力與環境pH值密切相關，環境pH值會影響酶分子的構象和酶分子及底物分子的解離狀態，從而影響酶的活性和酶促反應速度，pH值過高或過低均對酶促反應不利。認為適宜pH值為7.0。

蛋白質的分散性與電荷頻率及疏水性有關,高電荷頻率、低疏水性可以有效提高 其分散性。蛋白酶解過程可以改變蛋白質的結構，并提高電荷頻率，同時也增加疏水性，但由于電荷頻率的影響遠大于疏水性的影響，因此總的效果是增加蛋白質的溶解性。由圖4可見，當pH值為7時，大豆分離蛋白的分散性最高，偏離7時，酶活受影響，分散性降低，故最佳pH值為7.0。

3 結論

單因素實驗結果表明：加酶量、底物濃度、反應溫度及體系的pH值等因素在Protex7L酶解大豆蛋白中影響顯著。Protex7L的最適酶解條件為加酶量13.456AU/g、反應溫度55℃、底物濃度為10%、pH值為7.0，酶解時間為1h。在此條件下，水解度為1.57%，蛋白質分散指數為91.8%，可明顯改善大豆蛋白質的分散性，從而拓展其在食品加工中的應用范圍。

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