微生物對化學物質構效的影響研究進展*

張國民 ，譚周進 ，張 熙 ，蔡光先

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208； 2.湖南農業大學生物安全科技學院，湖南 長沙 410128）

微生物體積小，種類多，分布廣泛，代謝類型和代謝產物極其多樣，對人類生產、生活的影響巨大。微生物擁有極其復雜多樣的酶類，可以通過羥基化、環氧化、脫氫、氫化等氧化還原反應，或水解、水合、酯化、胺化、脫水、異構化和芳構化等反應改變物質的化學結構，進而改變其物理化學性質，影響其生理活性與功能[1]。現就微生物通過酶法修飾改變化學物質的結構，從而提高其活性，降低毒副作用，產生新活性物質等的研究進展綜述如下。

1 微生物作用可提高中藥活性

微生物通過對藥物中有效成分的修飾，可以顯著提高其生物活性，從而獲得更好的治療效果。微生物轉化提高藥物活性的主要表現方式有提高活性成分的量，改變活性成分的比例，生物轉化體系產生了次級代謝產物以及有效成分發生復方協同作用等[2]。

薛慧玲等[3]利用篩選獲得的β-葡萄糖醛酸酶產生菌HQ 210對黃芩中的主要前體物質黃芩苷進行發酵轉化，轉化后黃芩素得率是原藥材的5.3倍，有效成分得到濃縮。任莉穎等[4]通過微生物轉化反應炮制紅花，使紅花有效成分的酚羥基數目大幅提高，進一步提高了紅花的抗氧化性和生物利用率。

陳永強等[5]通過篩選得到的產β-葡萄糖醛酸酶的黃曲霉HG 12對甘草進行液體發酵炮制，發現甘草經黃曲霉HG 12轉化后，甘草中的甘草酸水解為甘草次酸。動物藥效學實驗證明，發酵后甘草的抗炎、鎮痛活性較未發酵甘草有顯著性提高，并且起效迅速。淫羊藿是常用中藥，主要成分為淫羊藿苷，有增強內分泌、促進骨髓細胞DNA合成和骨細胞生長的作用，而低糖基淫羊藿苷和淫羊藿苷元的活性均明顯高于淫羊藿。利用曲霉屬霉菌產生的誘導酶水解淫羊藿苷，可制得低糖基淫羊藿苷或淫羊藿苷元，且轉化率高[6]。虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖，主要有效成分白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗動脈粥樣硬化和預防冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量僅為0.1% ～0.2%，而虎杖苷含量為2%左右。張強華等[7]從中藥材虎杖中篩選到具有轉化虎杖苷能力的根霉菌株T 234，利用該菌株產生的β-葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉化為白藜蘆醇。苷類中藥生物利用度低，攝入后需經腸道細菌代謝水解生成苷元而發揮藥理作用。因此，將苷類中藥轉化成苷元，提高生物利用度是有效提高其藥效的一個重要方法[8]。人參皂苷Rg1在肝臟內基本不代謝，甘草皂苷、柴胡皂苷等也都是經過腸道微生物的轉化作用，才表現出抗炎、抗癌、抗病毒等藥理作用[9]。研究發現，腸道中的細菌 Bacteroides JY-6，Bacteroides SP.，Bifidobacterium SP.和 Fusobacterium SP.等能夠代謝人參皂苷成分[10]。趙玉婷等[11]從盾葉薯蕷根莖表面及葉片中篩選到可降解薯蕷皂苷為薯蕷皂苷元的菌株。沈嵐等[12]研究發現，不管是離體還是在體內條件下，麥冬皂苷D′在大鼠腸道菌作用下均能被代謝成薯蕷皂苷元，且最終在血液、尿液中也可檢出薯蕷皂苷元。羅漢果是葫蘆科植物羅漢果的干燥成熟果實，性涼、味甘，中醫用于治療百日咳、慢性氣管炎等。已有研究表明，羅漢果主要含有皂苷類化學成分，羅漢果皂苷（mogroside）Ⅲ是羅漢果總皂苷類化學成分中含量較高的成分之一。楊秀偉等[13]研究發現羅漢果皂苷Ⅲ可由人腸內細菌依次脫去C-3葡萄糖基和C-24龍膽二糖基，轉化產生羅漢果皂苷ⅡA1和羅漢果醇，從而大大提高了羅漢果有效成分的吸收率。

改變中藥有效成分的水溶性也可以提高其藥效活性。葛根素是葛根中的主要有效成分，但因其水溶性差，不能通過注射給藥。研究發現，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶可以顯著提高葛根素的水溶性，反應得到的兩種主要產物α-D-葡萄糖基-（1→6）-葛根素和α-D-麥芽糖基 -（1→6）-葛根素，其溶解度分別是葛根素的14倍和168倍[14]。去氫木香內酯和木香烯內酯為常用中藥木香的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、增強胃腸蠕動等藥理活性，但水溶性較差。為尋找活性和水溶性更好的藥物，李澤友等[15]利用多型孢毛霉 Mucor polymorphosporus AS 313443等真菌對去氫木香內酯進行制備型轉化，分離得到9個化合物，從而使其水溶性明顯提高。

2 微生物作用可降低化學物質毒性

2.1 降低中藥毒副作用

某些藥效明顯的中藥或化學合成藥往往伴有強烈的毒副作用，限制了其廣泛使用，而微生物轉化作用可以顯著降低中藥的毒性。微生物在轉化過程中主要通過對有毒物質進行分解或對有毒活性成分進行結構修飾，從而降低藥物的不良反應[16]。

五倍子的主要成分為五倍子鞣質、沒食子酸等，具有收斂止瀉、止血的作用，但鞣酸在腸道內會結合食物中的蛋白質，引起部分患者服用后食欲不振。鄭利華等[17]用含有根霉菌的酵曲發酵五倍子，發酵后能顯著提高五倍子的收斂作用，并降低或消除了由鞣酸引起的不良反應。大黃生用瀉下作用峻烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應，其瀉下作用成分主要是結合型蒽醌衍生物，故在中醫臨床中，常用不同的炮制方法使結合型蒽醌分解或破壞，從而緩和瀉下作用和其他副作用。戴萬生等[18]用酵母菌發酵大黃，結果大黃總蒽醌含量略有降低，結合型蒽醌含量降低，分離型蒽醌含量增加，起到了減毒增效的作用。

馬錢子因是劇毒藥而臨床應用受限，目前主要用砂燙法和油炸法降低其毒性。潘揚等[19]通過真菌對馬錢子進行“雙向發酵”，結果發酵后馬錢子類生物堿成分發生了質和量的明顯變化，提示該技術在馬錢子的減毒增效研究中有重要意義。喜樹是珙桐科喬木，其有效成分喜樹堿具有較強的抗腫瘤活性，但嚴重的胃腸毒性、抑制骨髓功能和致出血性膀胱炎等毒副作用制約了其進一步的臨床應用。10-羥基喜樹堿是喜樹堿的結構類似物，對多種癌癥具有顯著的療效，且毒副作用很低，但在喜樹中的含量僅為十萬分之二，提取分離費時、費力[20]。閔長莉等[21]采用無毒黃曲霉菌株T-419，將喜樹堿轉化為10-羥基喜樹堿，顯著降低其毒副作用，提高了生物利用度。蟾蜍甾烯為中藥蟾酥的主要有效成分，是一類C-17位連接六元不飽和內酯環的甾體化合物，具有強心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性，但其化合物對人體有一定的毒副作用，主要表現為呼吸急促和心律不齊，過量則會因麻痹而致死亡，從而嚴重影響了其臨床應用[22]。梁研等[23]利用毛霉屬真菌對蟾蜍甾烯化合物進行生物轉化，獲得了80余個轉化產物，其中大部分為新化合物，大大降低了蟾蜍甾烯化合物的毒性。洋地黃強心苷類藥物是一類有強心作用的苷類化合物，應用于臨床可以治療充血性心力衰竭。對其進行結構修飾以得到高效、低毒的強心苷類藥物，成為該類藥物研究開發的方向之一。胡之璧院士應用洋地黃懸浮培養細胞，篩選出洋地黃轉化菌株新月彎孢霉 Curvularia lunata和藍色犁頭霉 Absidia coerulea，經轉化后甾體母核C12位上增加了一個羥基，將洋地黃毒苷羥化為地高辛，從而降低了其毒性[24]。

2.2 降低環境中物質的毒副作用

隨著農藥的長期使用，環境中殘留農藥量不斷增加，并經食物鏈傳遞而污染農產品，對人類健康構成了威脅，影響社會的持續發展。在農藥污染的治理方法中，生物修復技術是目前國際上公認最安全的方法，而微生物修復在生物修復中起著主導作用。

微生物酶法修飾可降解環境中的有毒物質。阮少江等[25]研究發現，甲胺磷農藥經微生物產生的甲胺脫氫酶催化分解為氨基、磷酸根和甲醇等化合物，通過小鼠灌胃試驗證明，該農藥的毒性明顯降低。Mageong等[26]報道大腸桿菌產生的磷酸三酯酶能打開甲胺磷的P-S鍵。Hay等[27]發現了 Pseudomonas acidovorans M3GY以聯苯為碳源共代謝降解雙對氯苯基三氯乙烷（DDT）的途徑，該菌株先將 DDT 脫氯化氫生成 2，2-雙（4-氯苯基）-1，1，1-二氯乙烯（DDE），再由雙加氧酶在苯環上引入雙羥基，苯環開環后經一系列代謝過程生成對氯苯甲酸及對氯苯乙酸。阿特拉津是一種低毒除草劑，但長期大范圍使用易造成土壤、地表水、地下水等的污染，其降解菌主要有紅球菌（Rhodococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）等，降解途徑包括水解、脫烷基、開環3個過程，參與的酶主要有阿特拉津氯水解酶、阿特拉津乙氨基水解酶和N-異丙基氰尿酰胺異丙基氨基水解酶等[28]。

甲基化是微生物對環境中砷的一種重要解毒機制。自然界中，許多真菌和細菌能夠通過甲基化將無機砷轉化為毒性較低的甲基砷酸，如一甲基砷酸（MMAA）、二甲基砷酸（DMAA）、三甲基砷氧化物（TMAO）。張旭等[29]利用嗜酸硫桿菌 Acidithiobacillus ferrooxidans BY-3與 Acidithiobacillus thiooxidans BY-1對雄黃的微生物溶解與轉化進行了研究，毛細管電泳分析表明，可溶性的一甲基砷酸與二甲基砷酸為雄黃微生物溶出液的主要成分。

3 微生物轉化可合成新活性物質

在新藥的研發中，通常也利用微生物對已知成分的藥物進行轉化，進而篩選獲得新型、高效、低毒的藥物。在中藥開發中，由于中藥活性成分一般結構復雜，常有多個不對稱碳原子，利用化學合成來進行結構修飾存在著得率低、反應專一性差、副產物多等缺點。而利用微生物進行轉化容易生成新的化學結構，很多轉化產物具有新的活性，從而為新藥開發提供了難得的先導化合物[30]。以已知的天然活性成分為先導化合物，通過有機合成、結構改造等方法尋找和開發新的高效低毒藥物，是被實踐證明的開發新藥最行之有效的途徑之一。

利美索龍（Rimexolone）又名瑞美松龍，是一類新型甾體類眼科糖皮質激素藥物，具有較強的抗炎、抗過敏功能，用化學方法合成其前體化合物 16，17-dimethyl-17- （1-oxopropyl）androsta-1，4-dien-3-one后，在C11位上實現β-羥基化即可形成目的產物利美索龍，但該化學合成程序煩瑣且十分困難。張天智等[31]研究表明，絲狀真菌新月彎孢霉 Curvularia lunata具有對前體化合物C11 β-羥基化的能力，應用微生物轉化手段，直接對底物引入C11 β-羥基，合成目標產物，可以有效簡化利美索龍的生產工藝。王永宏等[32]篩選了一株高產β-葡萄糖苷酶的青霉菌株，對梔子進行發酵轉化，發酵條件優化后β-葡萄糖苷酶活性可達8.2 U/mL，使梔子中主要成分京尼平苷轉化成藥效更強的京尼平，且轉化率達95%以上。吳秀麗等[33]發現真菌菌株EST-Ⅰ與EST-Ⅱ能產生特異性水解C-6位葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，可以將人參皂苷Rg1定向轉化為稀有的人參皂苷F1。張卉等[34]使用微紫青霉對莪術醇進行了轉化，發現微紫青霉可將莪術醇轉化為15-羥基莪術醇，轉化率達到24%，且轉化產物為未見文獻報道的新化合物，體外試驗表明其對副流感病毒、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒Ⅰ型有較好的抑制作用。賈艷萍等[35]通過試驗確定 Absida SP.MS2為生產紅景天苷合成酶的出發菌株，可采用菌株 Absida SP.MS2發酵得到粗酶液，以酪醇和葡萄糖為底物合成紅景天苷。莪術油是中藥莪術的主要成分，具有抗腫瘤、抗病毒等功用，臨床用于治療宮頸癌、外陰癌、胃部腫瘤等疾病。莪術醇是莪術油的主要藥效成分之一，孫敏鴿等[36]使用蕁麻青霉 Penicillium urticae對莪術醇進行微生物轉化，結果分離到2個產物，結構分別鑒定為3-α-羥基莪術醇和11-R-12-羥基莪術醇，其中3-α-羥基莪術醇為未見文獻報道的新化合物。

綜上所述，微生物通過酶修飾作用于某些中藥，改變其有效成分的結構，就可以大大提高藥效活性；改變某些有毒物質的結構，就能起到減毒效果。微生物的次生代謝產物還可以和中藥的有效成分發生復方、協同作用。微生物通過酶作用，可以促進一些具有新活性的物質的合成。降解微生物擁有特殊的酶系，作用于各種污染物，可以改變其物質結構，將其徹底或部分降解成無機小分子物質，從而失去污染能力。微生物酶轉化通常是以天然活性成分為先導化合物，利用多種不同催化功能的酶體系對其進行結構修飾，這些修飾往往發生在化合物的母核結構上。在確定了中藥活性成分、有機污染物和轉化產物的對應關系的基礎上，如何從細胞和分子水平闡明轉化的反應機制，是更深層次的問題之一。這不僅需要鑒定反應的中間代謝產物，還需要推測可能的反應歷程，確定生物轉化反應的關鍵酶及其基因序列，進行關鍵酶的分離以及酶在組織和亞細胞中的定位等。因此，深刻了解微生物對化學物質構效的影響機制，有待微生物學、藥學、分子生物學和代謝工程等多學科的協同研究，努力探索生物轉化規律，為生物轉化的進一步發展開辟空間。

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