環氧合酶-2對胃癌淋巴管形成的影響

黃國民,劉林林,喬士興,房學東*

(吉林大學第二醫院1.普通外科疾病診療中心;2.腫瘤生物治療中心,吉林長春130041)

淋巴轉移是胃癌轉移的主要途徑,也是影響術后復發及判斷預后的重要指標。環氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,參與胃癌的發生發展,促進胃癌的淋巴結轉移[1]。腫瘤細胞通過淋巴管擴散到區域淋巴結是癌細胞侵襲性的重要表現,在癌組織切片中可見未成熟期淋巴管,在這些淋巴管中經常可以見到成簇的腫瘤細胞,提示腫瘤誘導的淋巴管生成可能是轉移進展的重要因素[2]。但有關COX-2對淋巴管形成的影響研究甚少,其具體機制仍不清楚。本研究旨在探討COX-2對胃癌淋巴管形成及預后的影響,并對其可能的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 對象與試劑

1.1.1 患者資料 收集我院2004年2月-2004年10月臨床資料完整的手術切除的并經病理證實的胃癌患者63例,其中男性為40例,女性為23例。年齡29歲-75歲,中位年齡54歲。所有標本術前均未接受放療和化療。組織學檢查為正常胃粘膜者20例源于胃鏡活檢標本。病理類型:高分化腺癌13例,中分化腺癌15例,低分化腺癌26例。TNM 分期:I期8例,II期13例III期18例IV期19例。本組63例均獲臨床隨訪,隨訪時間58-76個月,患者生存時間8-76個月,中位生存時間37個月。

1.1.2 主要試劑 人胃腺癌細胞系SGC7901購自中科院上海生物研究所,尼美舒利購于Sigma公司,前列腺素E2(PGE2)購于美國Cayman化學公司,羊抗人COX-2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,羊抗人VEGF-C單克隆抗體、VEGFR-3單克隆抗體購于武漢博士德生物技術開發公司,Western印跡法試劑盒購于美國Promega公司。VEGF-C上游引物5′-AGACTCAATGCATGCCACG-3′,5′-TTGAGTCATCTCCAGCATCC-3(435 bp)。β-actin:5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′,5′-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′(479 bp)。引物由上海生工公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 COX-2、VEGF-C、VEGFR-3 免疫組織化學檢測及淋巴管密度計數:按S-P免疫試劑盒說明書操作。COX-2、VEGF-C以細胞質染色為棕或棕褐黃色為陽性細胞,計算每例切片5個高倍視野中陽性染色反應細胞的百分率,小于10%判定為陰性(-),大于10%判定為陽性(+)。VEGFR-3染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇均為一個為微淋巴管計數,每例首先在低倍鏡下選擇MLD最高的腫瘤區域,在200倍光鏡下,隨機計數5個視野內微淋巴管數,再求其平均值,MLD以±s表示。

1.2.2 不同濃度尼美舒利對VEGF-C mRNA及蛋白表達的影響:用0、50、100和200 μ mol/L的尼美舒利作用細胞48 h,收集細胞,置于-80℃保存備用。提取mRNA進行定量和定性分析。RT-PCR:采用TRlzol一步法抽提胃癌組織總RNA,經DNA酶消化后逆轉錄。逆轉錄和PCR均設陰性對照。取5 μ l擴增產物加1 μ l溴酚藍,2%瓊脂糖電泳分析,凝膠成像儀分析逆轉錄PCR產物帶的積分吸光度值。用VEGF-C/β-actin擴增量表示細胞的相對表達水平。

分別用 0、50、100 、和 200 μ mol/L 尼美舒利作用SGC-7901細胞48 h。加入4℃蛋白裂解液,冰上裂解3 min;4℃1 000 g離心10 min;取上清,考馬斯亮藍測蛋白濃度,-80℃保存。取相同劑量的蛋白質樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后轉至硝酸纖維膜,5%脫脂奶粉封閉緩沖液室溫封閉30 min,加入1∶500稀釋的VEGF-C一抗,4℃孵育過夜。用Western印跡試劑盒檢測VEGF-C蛋白表達水平。

1.2.3 不同濃度的PGE2對SGC-7901細胞VEGF-C蛋白表達的影響:SGC-7901細胞分別加入濃度為0、50 、100、和 200 μ mol/L 的 PGE2,培 養 24 h,收 集細胞,按前述方法檢測VEGF-C蛋白表達水平

1.3 統計學處理

所有資料經SPSS10.0統計軟件分析。計量資料采用t檢驗,計數資料采用 χ2檢驗,相關分析采用Spearman等級相關分析,生存分析采用Kaplan-Meier曲線,單因素分析采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結果

2.1 COX-2和VEGF-C在胃癌中的表達及VEGFR-3標記的淋巴管特點

COX-2、VEGF-C在正常胃粘膜組未見表達。COX-2在胃癌組織中陽性率分別為77.6%(66/85),其陽性產物為棕黃色,位于癌細胞胞漿內;VEGF-C在胃癌組織中陽性率分別為72.9%(62/85),其陽性產物為棕黃色,位于癌細胞胞漿內,兩者差異具有顯著性(P＜0.05)。VEGFR-3陽性產物表達于腫瘤間質淋巴管內皮細胞胞漿中,淋巴管分布腫瘤周邊多于間質,形態大小不一;部分淋巴管內可見癌細胞浸潤。VEGFR-3在胃癌組織中MLD為(8.94±0.90)正常胃粘膜組MLD為(2.11±0.91),兩組相比,差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.2 COX-2與VEGF-C、MLD的表達關系

COX-2表達陽性的49例胃癌中有VEGF-C表達陽性的有42例,COX-2表達陰性的14例胃癌中有VEGF-C表達陽性的有 3例,兩者比較COX-2與VEGF-C表達呈顯著正相關(P＜0.05)。COX-2表達陽性的49例胃癌中平均MLD為12.05±0.21,而陰性的14例中MLD為5.13±0.29兩者比較差異有顯著性(P＜0.05)。

2.3 COX-2、VEGF-C與胃癌淋巴管形成和淋巴結轉移的關系

淋巴管密度與 COX-2(r=0.41,P=0.01)、VEGF-C(r=0.45,P＜0.01)、淋巴結轉移(r=0.69,P＜0.01)呈正相關。COX-2表達陽性的66例胃癌中有VEGF-C表達陽性的有57例,COX-2表達陰性的19例胃癌中有VEGF-C表達陽性的有2例,COX-2與VEGF-C表達呈顯著正相關(P＜0.05)。

2.4 COX-2、VEGF-C與胃癌預后的分析

經Kaplan-Meier生存曲線分析COX-2、VEGF-C表達均與生存率負相關,COX-2陽性表達組患者5年生存率15.6%陰性表達患者為36.8%,VEGF-C陽性表達組患者5年生存率16.8%陰性表達患者為35.7%,log-rank檢驗兩組生存曲線差異有非常顯著性意義(P＜0.05)。

2.5 COX-2對淋巴管形成的影響

選擇性COX-2抑制劑尼美舒利以劑量依賴性方式抑制SGC-7901胃癌細胞VEGF-C mRNA的表達。加入不同劑量的PGE2后,PGE2以劑量依賴性方式上調VEGF-C的表達,PGE2濃度越高,VEGF-C mRNA表達越明顯。

3 討論

環氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,在多種惡性腫瘤中表達上調,COX-2參與胃癌的發生、發展過程與淋巴結轉移密切相關[1,3]。有研究發現在人結腸癌中COX-2可通過上調VEGF-C表達,促進結腸癌的淋巴管形成[4]。然而,COX-2能否通過上調VEGF-C表達并促進胃癌淋巴管形成以及胃癌淋巴結轉移目前尚不清楚。

VEGF-C被認為是相對特異的淋巴管內皮生長因子,在對影響淋巴轉移的相關因素的研究中發現,VEGF-C及VEGFR-3是目前為止發現的一組調節胚胎組織淋巴管生成和成熟個體淋巴管生理功能的調節因子,它通過誘導微淋巴管的生成并影響淋巴管內皮的通透性,從而促進腫瘤轉移[5]。本研究表明VEGF-C與淋巴管密度、淋巴結轉移呈正相關,與生存率呈負相關,并影響胃癌患者的預后,COX-2表達與VEGF-C表達呈正相關。COX-2表達和VEGF-C表達與淋巴管密度呈正相關。有淋巴結轉移的患者COX-2、VEGF-C的表達明顯增高,并與患者的無病生存率和總生存率呈負相關。淋巴管密度是胃癌預后的獨立危險因素,提示COX-2和VEGF-C的高表達與胃癌淋巴管形成、淋巴結轉移密切相關,并影響胃癌患者的預后。

COX-2和VEGF-C在胃癌淋巴轉移過程中發揮的確切機制和關鍵步驟,迄今仍未明了。有研究認為少數COX-2為調節基因,推測某些未知的COX-2下游基因可能在腫瘤轉移中扮演重要角色。我們研究結果表明,胃癌組織中COX-2表達與VEGF-C呈正相關,COX-2特異性抑制劑尼美舒利可明顯抑制SGC-7901胃癌細胞VEGF-C mRNA和蛋白的表達,尼美舒利濃度越高,VEGF-C表達降低越明顯,其抑制效果呈劑量依賴性。另一方面細胞培養液中加入PGE2,可誘導VEGF-C表達上調,實驗表明,VEGF-C是COX-2的下游基因,COX-2通過PGE2上調VEGFC的表達,VEGF-C通過作用與內皮細胞上的受體,進而促進淋巴管的形成及淋巴結轉移。隨著COX-2、VEGF-C與胃癌關系研究的深入有可能為研究腫瘤的淋巴轉移開辟新的途徑。

[1]黃國民,房學東,丁相福,等.胃癌組織中環氧和酶-2的表達及意義[J].中國實驗診斷學,2008,12(8):1020.

[2]Sebastian FS,Guenther B,Klaus A,Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer[J].Ann Surg USA,2004,240(2):306.

[3]Duff SE,Li C,Jeziorska M,et al.Vascular endothelial growth factors C and D and lymphangiogenesis in gastrointestinal tract malignancy[J].Br J Cancer,2003,89:426.

[4]Soumaoro LT,Uetake H,Takagi Y,et al.Coexpression of VEGF-C and Cox-2 in human colorectal cancer and its association with lymph node metastases[J].Dis Colon Retum,2006,49:392-398.

[5]Zha S,Yegnasubramanian V,Nelson WG,etal.Cyclooxygenase-2in cancer progress and perspective[J].Cancer Lett,2004,215(1):1.