花粉管通道法在玉米轉基因育種中的應用

李向龍，張力全，張曉東

（北京農業生物技術研究中心，北京 100089）

玉米是世界主要糧食飼料和工業原料之一，隨著社會的不斷進步，世界各國對玉米的需求量逐年增加。預計到2020年，發展中國家對玉米的需求量估計會比1995年增加50%，到2030年,我國的玉米需求量將會達到1.60億 ～1.75億t[1]。但是，目前的玉米生產和玉米育種中面臨著推廣品種單一化、育種材料遺傳基礎越來越狹窄、基因庫日益貧乏的問題，加之常規育種周期長，預見性差，故20世紀70年代以來，研究者開始利用基因轉化方法 （如EFG介導原生質體轉化法、電激轉化法、子房注射法以及花粉管通道法等）定向改造玉米的某些性狀，加快了玉米的育種進程[2]。本文就目前玉米自交系轉基因育種中花粉管通道法應用的研究成果作一綜述。

1 花粉管通道法的提出

花粉管通道法是我國科學家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”報道的研究成果。其原理是將外源DNA片段在作物受粉后特定時期注入柱頭或花柱，外源DNA沿著花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉化不具備正常細胞壁的受精卵、合子及早期胚胎細胞[3]。花粉管通道法自問世以來，引起國際上的廣泛關注，美、歐、亞等一些實驗室將這一技術應用于稻、麥、棉、豌豆、牧草等基因重組和總DNA導入的研究中，其中在水稻、小麥等糧食作物上的應用比較多，在一定程度上拓寬了其種質基礎，但在改良玉米育種中應用較少。

2 花粉管通道法在玉米改良上的應用

2.1 研究內容

目前，花粉管通道法用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗蟲、抗除草劑以及提高植株抗逆性上，其中抗除草劑和抗Bt蟲蛋白基因的研究成果顯著，孟山都和先正達兩個國際知名公司已將其推廣應用于生產中。

2.2 研究成果

在玉米自交系改良中，國內外學者利用花粉管通技術獲得的品種有30多個。1986年Ohta在美國科學道技術取得了大量有價值的成果，據統計，每年利用此院報上報道應用外源 DNA與玉米花粉混合授粉，得到F0轉化率高達10%的胚乳基因轉移[4]。王秀君等采用花粉管通道法將含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表達載體pUmG2導入優良玉米自交系X90中，經檢測有陽性植株為29株[5]。張慧英等提取甘蔗DNA，采用該方法將其導入普通玉米自交系普7313，從自交后代中選出2個葉綠素、可溶性糖、蛋白質含量均比對照提高的優良株系；他們還將提取的糯質玉米12-9-10 DNA導入甜玉米自交系孟加拉超甜玉米，其后代產生了株高、穗位高、葉面積等性狀上的變異[6,7]。王罡等采用該技術，以生產上7922等9個優良玉米自交系為材料，將Bt殺蟲蛋白基因導入其中，最終得到3株抗性轉化植株[8]。關淑艷等利用該技術將淀粉分支酶基因的反義表達載體轉入玉米自交系鐵7922、吉853、丹 340、Mo17、5003 和春 09 中，初步證明外源目的基因已整合到玉米基因組中，并得到了轉化植株的種子[9]。劉丹梅以抗蟲的胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)為供體，以8個品種玉米為受體進行外源DNA直接導入，通過對抗性植株的初步分子鑒定，證實外源CpTI基因存在并整合入獲得的玉米基因組植主中[10]。此外，研究者還在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，例如丁群星等研究發現玉米矮花葉病毒 (MDMV)B株外殼蛋白在轉基因植株中表現出對MDMV的抗性；張永勝等人還研究了將抗旱耐鹽基因以及抗葉斑病基因導入玉米自交系中，并獲得了初步成功[11,12]。

2.3 花粉管通道法轉化方式

花粉管通道法將外源DNA導入玉米自交系中的轉化方式有柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、子房微注射法、開苞導入法等。但筆者結合自身經歷，認為柱頭滴加法不論從轉化效率還是對幼穗的傷害程度上都有一定的優勢。該方法的主要技術手段是選取自交授粉后18～26 h的玉米果穗，剪去距穗頂部l cm以上的苞葉和花絲，將DNA滴在切口處，外源DNA經花粉進入時形成的通道進入幼胚，從而完成外源DNA導入過程。1995年祁永紅等報道了利用豬頭滴加法成功將外源總DNA導入玉米自交系，此后又有研究者陸續報道了利用該法獲得了具有廣泛變異的不同類型的玉米自交系[13 ～15]。

3 花粉管通道法應用前景展望

花粉管通道法優勢眾所周知，其在玉米自交系轉基因育種中應用越來越普遍，但其轉化效率低仍然是制約其應用的瓶頸，如何進一步提高其導入率將是今后很長一段時間研究的重點；此外，對玉米受粉后花粉管通道形成的生理機制、導入外源DNA的最佳時間以及轉基因后代可能產生的變異等還不能很好的解決，這在一定程度上將限制其發展。今后，應當進一步完善分子育種技術的理論和應用研究，以充分發揮其簡便快速的優勢，提高育種水平，培育出更多更好的優良新品種。

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