大鼠體外循環模型研究進展

龍 翔,晏 浩,徐建軍

自體外循環(cardiopulmonary bypass,CPB)技術上世紀 50年代運用于臨床后,相關技術迅猛發展,但是圍 CPB期有關病理生理、物理損害和血流動力學改變等尚有諸多不明確因素[1-6]。為了闡明這一病理生理學過程,許多學者作了相關研究,以往較多為大動物模型,如兔、狗、羊和豬等[7-11],但建立這些模型費用昂貴、技術要求高、管理不便以及難以長期生存,故發展受到限制。大鼠的循環系統和人類十分相似,而且管理方便、手術操作簡便和易長期存活,故以大鼠為體外模型可以系統的研究體外循環圍手術期病理生理改變機制。至今,關于大鼠體外循環模型的報道逐漸增加,且取得了長足的進步,現將大鼠體外循環模型研究現狀做一綜述。

1 研究歷史

上個世紀 60年代,Popovic等[12]首先報道了低溫大鼠體外循環模型,他們使用的裝置包括:滾壓泵、薄膜式氧合器、熱交換器、濾泡器和靜脈儲血器等,血液由右心室通過重力作用引流,最后泵入頸動脈。整套系統的預充量為 13.7ml,其中氧合器占了 11.3m l。實驗當中,他們首先將穿刺好血管通道的大鼠冷卻到 14℃,然后連接好各管道進行低溫(14.0±0.2)℃轉機,之后大鼠體溫升至 22℃停止轉機,轉機過程當中,采用“平衡灌注法”,將大鼠放在天平上,根據體重調節灌注流量。灌注流量最大為 32m l/(kg·min),低溫時達到大鼠心輸出量的80%,常溫時達到 50%。75只實驗大鼠大部分順利脫機,但未報道長期生存。

之后,相繼有一些學者研究大鼠體外循環模型,各有特色,但都由于灌注流量、預充量和長期生存等問題未得到解決,限制了其發展。其中 Triggiani等[13]采用開胸建立大鼠體外循環模型,提出了“三叉戟狀”引流裝置,三個分支分別引流大鼠的左、右上腔和下腔靜脈,但是轉機流量只有 15～20 ml/(kg·min),轉機時間短,且脫機后存活時間短暫。Alxenade等[14]建立了轉機時間較長(＞6 h)的大鼠體外循環模型,其特色是使用了旋轉的盤型氧合器,預充量為 4.4m l,總預充量 12m l,預充液包括 Hartmnan溶液和肝素。其目標主要為檢測 CPB過程中血紅蛋白、紅細胞比容等血液學指標,并未考慮大鼠存活。Wehberg等[15]為了研究體外循環中氧化亞氮調節體內各器官水潴留的作用開胸建立了流量較大[125 ml/(kg·min)]的大鼠體外模型,右心房引流,左室心尖至升主動脈根部的插管,但是預充量高達30ml,超過了大鼠的正常血量,所有大鼠均未存活。

2 研究現狀

進入 21世紀后,大鼠體外循環模型相繼報道,其主要特色在于全流量、預充量小甚至無血預充、低溫或常溫心臟停搏和長期生存。

2004年,Gua-Hua Dong等[16]報道了常溫下全流量的大鼠體外循環長期存活模型,大鼠氣管插管,機械通氣,采用內徑為 4 mm的靜脈引流管連接置入右心房的穿刺管道引流靜脈血,1.6mm內徑的頸動脈灌注管道,流量可達到 100～150 ml/(kg·min)。轉機過程中,保持平均動脈血壓為 60～80 mmHg(1mmHg=0.133 kPa),大鼠的心率保持在210～280次/min。他們使用了特殊設計的專用動物膜肺,交換面積為 0.05 m2,預充量只有 4 Ml,血氣分析的結果顯示它完全可以滿足 60 min的灌流需氧量。這個模型的總預充量為 16 ml(新鮮同種異體血液和膠體液各半),恰好為成年大鼠全身血量的一半,這和臨床上的體外循環較為相似。實驗結果顯示,10只體外循環大鼠能夠存活 2周以上。

Bettina Jungwirth等[17]為了研究深低溫停循環技術后大腦損傷的機制,在 2005年建立了一種新的可長期存活的深低溫停循環體外模型,采用 4.5 Fr的多側孔靜脈引流管道引流右心房靜脈血,20 G穿刺管置入尾動脈灌注,體外循環初始流量達到160～180m l/(kg· min),隨著降溫(熱交換器、冰袋和冰毯)流量逐漸減半,約半小時肛溫下降到 16～18℃,大鼠心臟停搏,不同的停搏時間(0 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min)后大鼠復溫 ,同時恢復體外循環,復溫時間超過 40 min,肛溫至少達到 35.5℃后停止轉機。他們也采用了特制的膜式氧合器,預充為 4 Ml,交換面積為 558 cm2。在深低溫停循環過程中,動物不行機械通氣,但是,在轉機過程中給予吸入氧分數為 0.21的持續氣道正壓通氣,避免肺膨脹不全。此模型預充量減少到10 ml,而且無血預充(使用羥乙基淀粉)。在拔除血管插管后,大鼠仍然予機械通氣 1小時,同時收集殘留血液離心(2 000 r/min,10 min)后輸入大鼠體內。大鼠恢復自主呼吸后,將其放置富含氧氣的環境中12 h自由攝食、攝水。實驗結果顯示,大鼠的存活率和深低溫停搏持續時間呈劑量負相關性。90 min組以下的大鼠基本存活到術后 14天。

Ralf Günzinger等[18]設計了大鼠開胸主動脈夾閉和心臟停搏的體外循環模型,這個模型也使用了一個特殊設計的膜式氧合器,它的交換面積相對較大為 0.063m2,預充量卻很小為 4 ml,此外熱交換器的預充量為 0.6ml,內徑為4mm的12 cm長的灌注泵硅膠管道預充為 1.5ml,其他管道預充為 1m l,加上預留在靜脈儲血器中的 1 ml,總的預充量為 8 Ml,采用 4：1的羥乙基淀粉和碳酸氫鈉。避免需要同種異體血液,這與臨床實踐相符。他們采用右頸靜脈引流和右股動脈灌注,但為了監測左室收縮和舒張功能,在大鼠左右頸動脈和左頸靜脈均插入了管道,轉機前切開胸骨,阻斷主動脈。通過一帶負壓裝置的靜脈儲血槽,轉機后流量可達到 120 ml/(kg·min),同時迅速將肛溫降至 32℃,之后注入高鉀晶體心臟停搏液,停搏 30m in后,主動脈開放,復溫至 37℃。為了檢測心肌腫瘤壞死因子-a(TNF-a),白介素(IL)-6 mRNA的水平,停機后 60 min就將大鼠處死。此模型作者主要是采用導管技術監測術中左心室收縮舒張功能和術后心肌組織 TNF-a,IL-6mRNA的水平,并未考慮長期存活。

Fellery de Lange等[19]在 2008年報道了閉胸主動脈阻斷的大鼠體外循環和心臟停搏模型。此模型最大的特點是通過 B超引導置入主動脈瓣上方的雙腔導管,其前端有一氣囊,可充氣膨大阻斷主動脈,也可以通過此導管注射入心臟停搏液。而且他們采用腹壁尾側淺動脈監測血壓,減小了對大鼠的創傷。他們使用的膜式氧合器,預充量也為4 ml,交換面積為 558 cm2。整套系統共預充 10m l羥乙基淀粉。氣管插管機械通氣,右心房插管引流,尾動脈灌注。轉機后保持 150 ml/(kg·min)的流量,15 min后將插入主動脈瓣上方導管的氣囊注氣膨大阻斷主動脈,同時注射入適量心臟停搏液,讓心臟停搏30min,停搏過程中通過熱交換器保持體溫在 34℃。之后將氣囊抽空主動脈開放,恢復流量,而且復溫至37℃。脫機后繼續保持機械通氣一小時,然后將大鼠放置在溫暖和富含氧氣的環境中復活。大鼠均存活 14天以上。本實驗還有個特別之處:采用針狀熱敏電阻置入左側顳肌下測量顱骨膜溫度。此模型有諸多優點:創傷性小、容易存活、心臟停搏時間和體外循環轉機時間的可控性。

3 建立穩定實用、接近臨床的大鼠體外循環模型

3.1 氧合器和預充量 整個循環通路的預充量主要取決于氧合器。隨著醫療科技的發展,氧合器已經從早期使用的鼓泡式過渡到了現在使用的膜式氧合器。早期使用的鼓泡式氧合器預充量太大,并不適合建立一個接近臨床的動物模型。從目前各實驗室使用的膜肺來看,其交換面積大約為 0.05m2,預充量為 4ml,這樣循環通路總預充量可以控制在 10ml以內,使得無血預充得以實現,更加接近于臨床。使用 100%的氧氣在大鼠全流量[150～180 ml/(kg·min)]下,足以滿足大鼠機體的需氧量,而且在沒有行機械通氣的情況下,仍然可以達到足夠的氧合。

3.2 靜脈引流和流量控制 靜脈引流量的大小直接影響到流量的控制,也是模型成功的關鍵。不同的學者有不同的觀點,前端多孔管道心房插管、多極管道引流、增加心房和儲血槽的落差、虹吸作用和保持儲血槽的負壓都是增加靜脈引流量的方法。成年大鼠的心輸出量為 150～180m l/(kg·min),平均動脈血壓為80mmHg以上。只有灌注流量達到 150 ml/(kg·min)以上才為真正意義上的全流量模型,以上只有 Bettina Jungwirth[17]等和 Fellery de Lange[19]等的模型達到此流量。但達到流量的同時要考慮血壓的穩定和維持。此外,目前實現主動脈順行灌注的最佳方法為頸動脈插管。照 Fellery de Lange[19]的插管方法,在頸動脈置入一根三腔多功能管,既可阻斷主動脈又可向心臟注射入心臟停搏液,還可以進行灌注,不失為一種很好的辦法。

3.3 心臟停搏 正中開胸、直接插管、主動脈夾閉和注射心臟停搏液,是臨床心臟手術常規的步驟。此模型中,不可能追求與臨床完全一致,Ralf Günzinger[18]等的模型除了直接插管外,基本采用臨床模式,同時雙側頸動脈插管監測心臟功能,大鼠均未存活。Ralf Günzinger[18]等的深低溫停循環技術和 Fellery de Lange[19]等的插管主動脈阻斷、注射心臟停博液是目前最為實用的心臟停搏技術。但是,深低溫停循環技術中缺乏完全有效的溫度控制。后者也存在一些潛在的缺陷,動脈導管需精確地置于主動脈瓣旁。超聲影像是必須的,當導管沒有置于最佳位置,會造成不完全阻斷,氣囊可能會損害頭壁干或者左心室。如果氣囊注射過大,很可能造成左心室擴張。

3.4 術后存活 體外循環后大鼠的存活期,對研究CPB后機體的病理生理變化機制及探討臨床保護策略極其重要。目前大多數學者采用纖維喉鏡輔助下的氣管插管技術或直接插管法建立氣道,避免了氣管切開后帶來的并發癥問題[16-22]。此外不開胸利于大鼠轉流后呼吸功能的恢復。轉流中和轉流后的血氣、電解質的監測和調整也是存活的必要條件之一。創傷最小化、保持胸廓的完整性是使動物術后能夠長期存活的重要條件,預充液量的大小對此也有較大影響。Bettina Jungwirth[18]等和 Fellery de Lange[19]等為了提高生存時間做了如下的處理:轉流結束后繼續機械通氣一小時,同時將殘留血液離心收集紅細胞輸入大鼠體內,大鼠恢復自主呼吸后將大鼠放置溫度適宜、富含氧氣的環境中讓其自由攝食、攝水。

4 研究展望

理想的大鼠 CPB模型應該是操作簡便、無血預充、主動脈順行灌注、全流量、可控性強和存活時間長。Fellery de Lange[19]等的大鼠 CPB模型創傷性小、容易存活、心臟停搏時間和體外循環時間的可控性,似乎接近理想狀態,但是臨床上的正中開胸、心臟直接插管等常規步驟沒有實施。我們的目標是追求一個理想的和臨床大致相似的大鼠 CPB模型裝置,但是正中開胸,直接插管等必然會明顯降低大鼠存活率。為解決這一矛盾,隨著醫療科技的發展,我們可以進一步改進循環通路各元件,進一步改良設計各插管途徑甚至開胸路徑,根據自己科研的需要設計出簡單合理實用的理想的大鼠 CPB模型。

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