急性胰腺炎動物模型不同造模方法與腸道細菌易位的關系

許娟娟 劉俊 侯曉華

·綜述與講座·

急性胰腺炎動物模型不同造模方法與腸道細菌易位的關系

許娟娟 劉俊 侯曉華

重癥急性胰腺炎(SAP)是病死率極高的病癥之一。由于其病因、發(fā)病過程、病變程度等因人而異，治療措施的研究也受到限制，故目前關于SAP的研究更多地依賴于急性壞死性胰腺炎(ANP)動物實驗。1986年Beger等人提出腸道細菌易位是引起胰腺組織壞死性感染的主要原因[1]。腸道動力改變所伴隨的腸道菌群變化、腸屏障受損以及免疫應答紊亂被認為是SAP腸道細菌易位的三個重要環(huán)節(jié)。不同的動物模型影響著腸道細菌易位的不同環(huán)節(jié)，而且造模技術本身也會影響腸道細菌易位[2]，所以了解各種ANP動物模型的特點對于更有效地研究SAP腸道細菌易位具有相當重要的意義。

一、已證實影響腸道細菌易位的ANP模型

1．胰膽管注射法：經胰膽管內注射膽汁、有菌或無菌的膽鹽以及激活的胰酶均能誘發(fā)ANP，最常用的是牛磺膽酸鈉。該模型可破壞胰管黏膜屏障，引起胰腺水腫、自溶、血流量降低，乃至胰腺實質壞死。實驗大鼠的死亡率與藥物濃度、注射量及注射壓力均有關[3]。Aho等[4]在大鼠胰管內注射3%、4.5%或5%的牛磺膽酸鈉0.2 ml/kg體重，前兩種濃度的動物72 h死亡率分別為23.5% 和71.4% ，而5%濃度者在31 h內全部死亡。采用定時定量裝置準確地控制注射壓力和速度，同一批實驗動物胰腺壞死程度相差無幾；如果壓力不加控制，不同課題之間所誘導的急性胰腺炎(AP)嚴重程度會有很大的差異。有實驗研究報道，大鼠胰管所能承受的最大壓力為30～50 mmHg(1 mmHg=0.133kPa)。

雖然此造模技術具有迅速和可重復性的優(yōu)點，但是它會影響腸道細菌易位，除了手術過程中抓捏小腸會潛在性地影響?zhàn)つて琳瞎δ芡猓毦梢蚴改c乳頭穿刺經乳頭移行入胰膽管以及潛在性地進入腹腔[5]。此模型成功的關鍵在于：嚴格無菌操作，減少因腹膜感染對模型的影響；找到胰膽管在十二指腸處的開口，并準確逆行注射，爭取進針一次成功；造模后嚴密觀察動物，防止其舌根后墜或分泌物堵塞氣道引起的意外死亡。

2．雨蛙素灌注法：由Lampel和Kern于1977年首次報道[6]。灌注低劑量的雨蛙素(膽囊收縮素和胃泌素的類似物)可在不引起細胞壞死的情況下提高胰腺的外分泌功能，并使胰蛋白酶原在胰腺內激活，引起急性水腫性胰腺炎，與人類輕癥急性胰腺炎相似。雨蛙素所誘導的AP特點是病變較輕、重復性好，因此成為輕型AP和缺血對胰腺的影響以及水腫性胰腺炎轉變?yōu)閴乃佬砸认傺讬C制研究的常用模型，也可用于氧自由基清除劑治療ANP效果的研究[7]。

需注意的是雨蛙素會降低腸道動力從而影響腸道細菌易位。有研究顯示，它可使腸道傳導時間延長，小腸動力降低，導致小腸細菌過度生長，并且向腸外易位增加[8]。因此，雨蛙素會通過改變腸道動力來干擾腸道細菌易位。

3．胰膽管注射和雨蛙素刺激：Schmidt等[9]報道，經大鼠胰膽管聯合注射膽鹽和雨蛙素誘導SAP模型，比其他模型更能模擬人的胰腺炎疾病過程[10]，是“一種能更好評估療效的模型”。雖然它被證實是一種非常有價值的模型，但是它具有逆行胰膽管注射法和雨蛙素注射法雙重的缺陷，在分析結果時還是必須考慮造模相關的干擾因素。

4．胰管結扎法：此模型通過阻止胰腺分泌物順利流出及膽汁反流入胰管誘導胰腺炎，以水腫、輕微的炎癥和少量的腺泡壞死為特點。但在美國負鼠中應用此法造模可誘導ANP[11]。

由于膽汁分泌受阻可導致小腸細菌的過度生長和細菌的易位，胰蛋白酶缺乏會改變腸道的通透性，阻塞所致的黃疸也導致免疫系統(tǒng)的受損，這些均可干擾實驗結果[12]。

5．十二指腸閉襻法：該法是結扎膽總管開口遠近各1 cm的十二指腸，24 h后胰腺出現水腫，胰頭部出血和胰周脂肪壞死。其機制是十二指腸腔內壓力增高，使膽汁反流入胰管，膽汁破壞了胰管上皮的黏膜屏障，反流入胰管的膽汁卵磷脂被胰液的磷脂酶A2分解為可破壞細胞膜和導管的溶血卵磷脂，胰內蛋白酶激活，導致胰腺水腫、出血和壞死。本模型主要用于研究ANP的發(fā)病機制[13]，因動物多死于腸壞死，故較少用于治療性研究。

該模型的病情有很大的多變性。胃腸管道的不連續(xù)性可導致黏膜萎縮和屏障功能的改變[14]；膽汁流向腸道受阻會導致腸道動力的降低，小腸細菌過度生長增加了腸道細菌易位的可能[15]；十二指腸內容物反流，包括細菌可逆行進入胰膽管。因此，限制了其在研究腸道細菌易位中的應用。

6．飲食誘發(fā)：Farber和Popper等[16]于1950年給小鼠服用乙硫氨酸誘發(fā)出ANP。1975年Lombardi等[17]應用缺乏膽堿的乙硫氨酸(CDE)飲食誘發(fā)雌性小鼠ANP和脂肪壞死。其機制為乙硫氨酸在體內能與甲硫氨酸相拮抗，干擾胰腺蛋白質和RNA的代謝，造成胰腺腺泡的損傷，其病變的形態(tài)學與人類SAP十分類似。動物死亡率與飼喂CDE的時間有關。飼喂CDE食物4 d的死亡率為100%；僅飼喂1 d，則死亡率為66%。人們可以通過改變飼喂CDE的時間，將死亡率控制在理想的范圍內。

由于此模型會出現全身并發(fā)癥，如腮腺炎和脂肪肝，使得它在研究SAP的全身反應免疫應答中較少應用[18]。另外，此模型胰腺感染的發(fā)生概率太低，很難進行手術介入一類的治療干預研究，同時CDE食物在國內不易獲得。這些均制約了它在AP腸道細菌易位中的應用[19]。

二、未證實是否會影響腸道細菌易位的ANP模型

1．L-精氨酸注射法：Tani等首次報道大鼠腹腔內注射過量L-精氨酸(50 μg/10 kg大鼠體重)后導致大鼠血清淀粉酶及脂肪酶升高，胰腺變性壞死，證明腹腔內注射過量L-精氨酸能誘導大鼠ANP模型。此法制備簡單，可重復性好，但目前還未發(fā)現其對腸道細菌易位的影響。

2．高鈣血癥法：1990年Frick給貓灌注葡萄糖酸鈣(0.6 mmol·kg-1·h-1)，提高胰腺局部血鈣水平，誘發(fā)出血壞死性胰腺炎。在外周持續(xù)性灌注同劑量葡萄糖酸鈣也可誘發(fā)典型的ANP。1994年Frick又給雌性大鼠(300～400 g)尾靜脈滴注CaCl2(0.6 mmol·kg-1·h-1)，持續(xù)12 h。組織學檢查發(fā)現在胞質內有酶原顆粒聚集，胞質空泡化，腺泡壞死水腫，失去極性[20]。機制是與高血鈣引起胰腺損傷及Ca2+在細胞內過量積聚有關。PLA2可降解膜磷脂生成具有生物活性的溶血卵磷脂，引起膜結構排列紊亂和功能障礙。一旦溶酶體膜受損或可釋放Cathepatin B，后者能直接激活胰蛋白酶原，該酶再激活其他酶原，引起細胞自身消化。此外，當細胞內Ca2+異常升高時還能引起線粒體功能障礙，ATP合成減少，依賴ATP的離子泵功能喪失，最終導致細胞死亡。高血鈣誘發(fā)的ANP模型主要用于對其病因學的研究。但還未證實會影響腸道細菌易位。

3．動脈注射微球：1862年Panam及Pfeffer將微球注入血液循環(huán)中誘發(fā)出出血性胰腺炎。近年Redha等將20 μm塑料微球注入大鼠脾動脈供胰分支，27 h后出現急性出血性胰腺炎。本模型主要用于研究缺血對胰腺的影響，以揭示缺血在SAP發(fā)病中的作用，同樣也未發(fā)現此模型對腸道細菌易位的影響。

三、結語

縱觀各種ANP造模技術與腸道細菌易位的關系，可以發(fā)現目前很多常用的ANP造模技術可通過影響腸道動力、損害腸黏膜屏障及影響機體免疫功能三個環(huán)節(jié)中的某個方面干擾腸道細菌易位。另外，外科操作本身也會增加假陽性概率，因此我們應排除選用統(tǒng)一的ANP動物模型的觀點，而要根據不同的實驗目的選用不同的動物模型。

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2009-04-06)

(本文編輯：屠振興)

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