RP-HPLC同時測定珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量

丁林芬， 郭亞東， 吳興德， 馬銀海

(1.昆明醫學院藥學院，云南昆明650031;2.昆明學院化學科學與技術系，云南昆明650031)

珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)為報春花科珍珠菜屬植物，又名扯根菜，紅根草等。全草入藥，具有清熱解毒、活血調經、利水消腫等功效［1］。黃酮類化合物是珍珠菜中的主要化學成分［2-3］，過去在含量研究方面主要采用紫外分光光度法測定黃酮的含量［4-5］，但同時測定珍珠菜中槲皮素和山柰酚含量的方法未見報道，本實驗建立反相高效液相色譜法同時測定珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量測定方法，進一步完善了珍珠菜的質量控制體系。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 Agilent 1100 series高效液相色譜儀，包括四元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，紫外檢測器，Agilent色譜工作站。

1.2 試劑 乙腈為色譜純(美國Merk公司)，水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.3 材料 槲皮素對照品(自制，用面積歸一化法測定其含量＞98%)，山柰酚對照品(自制，用面積歸一化法測定其含量＞98%)。珍珠菜樣品采自云南省大理市，由中國科學院昆明植物研究所李錫文教授鑒定為珍珠菜L.clethroides，標本現存于該所標本室(標本號2006-19)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相:乙腈-水(含0.4%的磷酸)，梯度洗脫(0～15 min，17∶83～40∶60)，流速:1 mL/min，檢測波長:360 nm，柱溫:40°C。在上述色譜條件下，對照品和樣品的色譜見圖1。

2.2 對照品和供試品溶液的配制

圖1 珍珠菜的高效液相色譜圖

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取對照品槲皮素5.7 mg，山柰酚5.9 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。分別精密吸取貯備液各1 mL，置于100 mL量瓶中，混勻，制得濃度分別為0.005 7 mg/mL的槲皮素及0.005 9 mg/mL的山柰酚混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取珍珠菜粉末約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入70%甲醇50 mL，溫度80°C，稱定重量，熱回流3 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足重量，搖勻，即得供試品溶液。進樣前取適量溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，槲皮素及山柰酚的回歸方程分別為:

結果表明槲皮素在0.005 7～0.114 μg范圍內線性關系良好;山柰酚在0.005 9～0.118 μg范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 分別精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄色譜圖，結果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.85%，0.72%。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0，2，4，6，8 h進樣，記錄色譜圖，結果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為1.65%，0.88%，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品6份，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別測定槲皮素和山柰酚的含量，結果槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為1.45%，1.79%，表明本方法重復性良好。

2.3.5 回收率試驗取已知含量的珍珠菜粉末(每克含槲皮素56.5 μg，山柰酚29.2 μg)，共9份，分別加入相當于樣品中槲皮素和山柰酚含量的80%，100%，120%的對照品溶液各3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以回歸方程計算3種濃度的平均加樣回收率，槲皮素的平均加樣回收率為97.3%，RSD為1.12%(n=9)，山柰酚的平均加樣回收率為97.2%，RSD為1.94%(n=9)。結果見表1。

2.4 樣品含量測定 取不同批次的珍珠菜粉末1 g，共3批，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，記錄槲皮素和山柰酚的峰面積，由線性方程計算各自含量，測定結果見表2。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇 本實驗分別考察了提取溶劑，時間，溫度及料液比等因素對珍珠菜中槲皮素和山柰酚提取率的影響，并進行了單因素實驗。結果表明:在70%甲醇，1:50料液比，80°C熱回流3 h的條件下，槲皮素和山柰酚的提取率最高。

3.2 流動相的選擇 用乙腈-水二元系統進行等度洗脫，槲皮素和山柰酚的保留時間過長，改用梯度洗脫程序，保留時間縮短且峰形得到較大的改善。由于槲皮素和山柰酚的結構式中含有羥基，故在流動相中加入磷酸，從而使其峰形得到較好的改善。實驗證明，在此條件下能得到較好的結果。

表1 槲皮素和山柰酚加樣回收率測定結果(n=9)

表2 珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量(μg/g，n=3)

3.3 檢測波長的選擇 經紫外掃描，槲皮素和山柰酚在360 nm處有最大吸收，故本試驗采用360 nm的檢測波長對槲皮素和山柰酚的含量進行準確檢測。

［1］衛生部中華本草編委會，國家中醫藥管理局.中華本草［M］.第6卷.上海:上海科學技術出版社，1999:96-98.

［2］鄒海艷，屠鵬飛.珍珠菜黃酮類化合物的研究［J］.中國天然藥物，2004，2(1):59-61.

［3］任風芝，郄建坤，屈會化，等.珍珠菜脂溶性部位的化學成分研究［J］.解放軍藥學學報，2001，17(4):178-180.

［4］唐麗華，徐向毅，薛振德，等.珍珠菜中黃酮類成分的分離和含量測定［J］.抗感染藥學，2005，2(3):118-120.

［5］游本剛，唐麗華，劉揚.紫外分光光度法測定珍珠菜中總黃酮含量［J］.中國野生植物資源，2007，26(1):43-45.