黃精多糖的提取及其對α-葡萄糖苷酶抑制作用

高 英， 葉小利， 李學剛*， 朱小康， 王 亮， 黃文文， 李 平， 馮 平

(1.西南大學藥學院，重慶 400716;2.西南大學生命科學學院，重慶 400715;3.北碚區中醫院，重慶400700)

糖尿病是以持續高血糖為基本生化特征的一種綜合病癥。主要是由于體內胰島素相對或絕對不足所引起的糖代謝紊亂所致［1］。糖尿病患者長期高血糖狀態可產生多種并發癥［2］。臨床用于治療Ⅱ型糖尿病的藥物主要分為1)胰島素及類似物;2)口服降血糖藥:主要有磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖抑制劑和胰島素增敏劑等藥物。西藥治療糖尿病療效值得肯定，但各種西藥降糖藥物都有消化道反應、肝、腎損害等副作用，且不能有效控制并發癥。中醫治療糖尿病療效穩定，作用溫和，不良反應少，能有效防治并發癥［3］。因此開發利用天然植物中藥成為目前糖尿病防治藥物研究中的熱點。

黃精為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Red.)的干燥塊莖［4］，是我國傳統中藥，具有悠久的降血糖應用歷史。市面上許多降糖中成藥如降糖通脈片、黃精降糖膠囊等其主要降糖成分均為黃精。黃精多糖是其主要活性成分，具有降血糖［5］、抗衰老作用［6］、增強免疫功能［7］等多種功效。

針對黃精的降血糖活性研究，已有很多文獻報道，但大多采用動物實驗驗證從其提取的活性成分的功效，對于以α-葡萄糖苷酶為靶標，在黃精中篩選降血糖活性成分卻較少。因此我們采用α-葡萄糖苷酶對黃精多數活性物質中具有降血糖活性的成分進行篩選，在黃精中篩選出高抑制活性的成分之后，對高抑制活性的成分進行提取、分離、純化和成分鑒定，及對其進行結構分析，并研究了各組分對糖尿病小鼠的降血糖作用。

1 材料

1.1 藥材 試驗材料黃精購自重慶北碚藥材市場，由西南大學藥學院李學剛教授研究鑒定。

1.2 試劑 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，Sigma公司;谷胱甘肽，Sigma公司;所用標準單糖:D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，均為Sigma產品;蒸餾水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);Hitachi U-1800型紫外分光光度計(日本Hitachi儀器公司);CS1013電熱鼓風干燥箱(中國重慶實驗設備廠);FD-ID冷凍干燥箱(北京博醫康實驗儀器有限公司);Perkin Elmer one紅外分析儀(Perkin-Elmer公司);DEAE纖維素柱(上海亞榮生化儀器廠);GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.4 動物 清潔級昆明種小鼠，體重18～22 g，由重慶第三軍醫大學動物室提供。

2 方法

2.1 多糖的提取 500 g黃精置于70℃烘箱烘干，粉碎，5倍工業乙醇提取3次，減壓濃縮至干，得到浸膏153.7 g。雙蒸水1:5溶解浸膏，超聲溶解。對多糖提取液需進行脫色處理，即以1%的比例加入活性炭。然后以α-葡萄糖苷酶為靶標測定活性組分位于有色部分或者是脫色后提取液部分。

2.2 多糖的分離純化 確定研究對象后，用Sevage法去除樣品中的蛋白質，即用氯仿:戊醇或丁醇，4:1比例混合，加到樣品中振搖，使樣品中的蛋白質變性成不溶狀態，離心除去;通過逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質。

2.3 多糖的鑒定

2.3.1 溶解性:稱取純化后的多糖0.5 g，加入3 mL的水，常溫下攪拌，觀察其溶解性。

2.3.2 Molisch反應(α-萘酚反應):取檢品的水溶液1 mL，加5%萘酚試液數滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，使成兩液層，待2～3 min后，觀察兩層液面出現環的顏色。

2.3.3 淀粉的碘反應:將純化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2 mL，水浴加熱，觀察顏色是否有變化，同時做淀粉的對比試驗。

2.3.4 紅外圖譜分析:將多糖與溴化鉀烘干后，稱取多糖2 mg與100 mg的溴化鉀研磨，壓片，置于紅外圖譜分析儀中作紅外分析。

2.4 4個不同分子量級透析袋將活性組分分成4段，α-葡萄糖苷酶測定各組分活性，苯酚-硫酸法測定4個分子量級多糖含量［8］。

2.5 黃精多糖中單糖的組成分析

在趙國華［9］法基礎上進行改進:實驗前取一平底玻璃燒瓶，塞上膠塞，膠塞上插入兩根小細管，一根進氣，一根排氣。分別取各分子量級的黃精多糖10 mg置于其中，加入2 mL 2 mol/L三氟醋酸(CF3COOH)，塞上塞子通N2。待反應體系的空氣已被N2交換完畢，即拔出管子，密封反應體系。置于油浴120℃水解2 h，冷至室溫，用玻璃棉濾去殘渣，用少量水洗殘渣2次，合并濾液，減壓蒸干，再加少量水3次，減壓蒸干以除去殘存的CF3COOH。水解物在真空干燥箱中70℃減壓干燥過夜。分別加入約10 mg鹽酸羥胺及1 mL無水吡啶，溫熱溶解后在90℃反應30 min，冷至室溫，加入1 mL無水醋酸酐，在90℃下繼續反應30 min，冷卻至室溫，加入1 mL H2O攪拌，再用氯仿萃取3次，每次1 mL，合并氯仿層，減壓抽干。置真空干燥箱減壓干燥24 h。同法制備各種標準單糖的糖腈乙酸酯衍生物，分別進行氣相色譜分析。

無水吡啶的制備:吡啶用KOH干燥，經分餾柱進行蒸餾，收集114℃ ～116℃餾分。

無水醋酸酐的制備:醋酸酐經無水硫酸鈉干燥，蒸餾收集139℃組分。

色譜條件:OV-225石英毛細管柱;FID檢測器，進樣口溫度250℃，柱溫100℃程序升溫，100℃(1 min)6℃/min至180℃(1 min)，3℃/min至240℃(1 min)，載氣為高純氦，分流比10∶1。

2.6 α-葡萄糖苷酶法測定抑制活力 在Pierre［10］法基礎上進行改進:取pH 6.8磷酸鹽緩沖液2010 μL，適待測樣品溶液250 μL，3 mmol/L 的谷胱甘肽80 μL 和實驗室自制 α-葡萄糖苷酶 80 μL，混勻，37℃恒溫水浴保溫10 min，再向反應體系中加入80 μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，立即于400 nm處測定在酶的作用下釋放出對硝基苯酚pNP的量，不加待測品溶液作為空白對照(pH 6.8磷酸鹽緩沖液補足)，每2 min讀取一次吸光度值A并記錄，記錄30組值。每個樣品同時做3個平行，取平均值，然后做吸光度A隨時間t變化的關系曲線，可以發現吸光度A與時間t成正比例關系。取斜率K值，計算各組分抑制率。

抑制率 =(K空白-K樣品組)/K空白

2.7 對糖尿病小鼠的降血糖作用 取180只健康小鼠，♀♂各半，平衡飼養3 d。采用尾部靜脈注射四氧嘧啶，注射劑量70 mg/kg。3 d后測定空腹血糖。血糖值15.0～24.0的小鼠為成功造模小鼠，總計140只。將140只小鼠隨機分成7組，每組20只，分別為空白組，阿卡波糖組，黃精浸膏組，4組不同分子量的黃精多糖組，按表5中劑量給藥，1次/d，分別給藥后第6天，第9天采用尾靜脈取血，血糖儀測定空腹血糖值［11］。

3 結果與分析

3.1 黃精多糖對α-葡萄糖苷酶影響研究結果 脫色后，α-葡萄糖苷酶法測定，結果顯示脫色后的提取液的抑制率為84%，而有色部分抑制率為38%，活性絕大部分位于脫色后的提取液中。

3.2 多糖的鑒定

3.2.1 溶解性:通過攪拌，純化后的黃精多糖溶解性好，溶解后無雜質。

3.2.2 Molisch反應(α-萘酚反應):通過觀察，可看到兩層液面出現紫紅色環。

3.2.3 淀粉的碘反應:結果顯示，多糖溶液沒有變藍的現象出現，說明溶液中不含淀粉，提取液中成分不是淀粉。

3.2.4 紅外圖譜分析:將純化后的多糖進行紅外光譜掃描，結果如圖1。

圖1 黃精多糖紅外吸收光譜Fig.1 Infrared absorption spectrum of polysaccharide

從紅外光譜圖可知，所提黃精多糖具有典型的多糖吸收峰，其特征吸收峰及所對應的功能團見表1［12］。

表1 黃精多糖紅外吸收光譜數據Table 1 Data of infrared absorption spectrum for polysaccharide

3.2.5 α-葡萄糖苷酶測定4個分子量級黃精多糖組分活性高低，結果如表2。

3.2.6 各分子量級黃精多糖含量測定:苯酚-硫酸法測定各各分子量級別黃精多糖的含量，結果如表3。

表2 4個分子量級多糖組分活性Table 2 Inhibit activity of four molecular-level polysaccharide

表3 4個分子量級多糖組分含量Table 3 Content of four molecular-level polysaccharide

3.2.7 黃精多糖的組成分析:氣相色譜分析酸水解后各分子量級黃精多糖，結果如表4。

表4 4個分子量級多糖的單糖組成及含量Table 4 Monosaccharide composition and content of four molecular-level polysaccharide

3.3 黃精浸膏及各級分子量黃精多糖的降血糖作用

從表5的統計結果顯示，黃精多糖組(2 000＜M＜14 000)具有較好的降血糖功效。

表5 黃精浸膏及4個分子量級黃精多糖對四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影響Table 5 Effect of extract from Polygonatum sibiricum and four molecular-level polysaccharide on blood sugar of diabetic mice induced by streptozotocin

4 討論

本實驗以α-葡萄糖苷酶為靶標，對黃精的降糖活性成份進行篩選。將篩選出來的降糖活性成分-黃精多糖，提取純化后以分子量為基礎進行分段，這樣把分子量、多糖組成、單糖比例三者聯系在一起，對傳統的黃精多糖分析方法-提取、純化、水解后分析單糖組成、構效關系，做出補充。實驗結果表明:黃精多糖對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制作用。進一步的分析發現，單一葡萄糖形成的多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性最強，降糖活性也最強。

本實驗采用酸水解、乙酰化和氣相色譜法進行單糖組成分析。實驗前自制反應環境-實驗前取一平底玻璃燒瓶，塞上膠塞，膠塞上插入兩根小細管，一根進氣，一根排氣。較之于趙國華［9］法水解時封管實驗，這樣操作起來更加簡便。

傳統的針對黃精的降血糖活性研究，大都采用提取出活性成分之后再做動物實驗檢驗其藥理功效的方法，這樣費時費力。我們課題組實驗的創新之處是用α-葡萄糖苷酶對黃精中多數活性物質中具有降血糖活性的成分進行篩選。這樣可以就活性成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用做出比較，且在實驗的后續工作中，更能有針對的提取活性成分，比傳統方法更經濟，更具可行性。

傳統的α-葡萄糖苷酶法如 Pierre［10］等的方法，以pNPG為底物，Na2CO3溶液作為終止液，測定α-葡萄糖苷酶活性。抑制率計算公式為:抑制率 =(A空白-A樣品組)/A空白。而本研究在酶、抑制劑37 ℃水浴保溫10 min后加入pNPG，于波長400 nm處測定在酶的作用下釋放出硝基酚的量，每2 min測定一次吸光度A，以A隨時間t變化的斜率K值作為計算抑制率的依據。此種測定方法是以檢測時間內的平均值作為計算的依據，這樣可以減少實驗環境、人為因素的影響，比傳統的方法更準確，同時也容易觀察各抑制劑的抑制效果隨時間變化的關系。

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