芙蓉凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

曾祖平， 劉 釗， 張 虎， 何 薇， 王 宏， 王永紅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京100010)

芙蓉膏為北京中醫(yī)醫(yī)院皮外科常用的傳統(tǒng)軟膏劑，由黃連、黃芩、大黃等藥味組成，具有清熱解毒，活血消腫的功效，主治丹毒、蜂窩組織炎、癤、癰初起等［1］。原制劑為藥材粉碎后直接加入凡士林基質(zhì)中，藥材有效成分利用度低，軟膏油膩，易污染衣物。為提高其臨床療效，便于使用，我們將芙蓉膏改進(jìn)為凝膠劑，對(duì)其工藝進(jìn)行了研究［2］。本實(shí)驗(yàn)建立了芙蓉凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和儀器

芙蓉凝膠(自制);芙蓉凝膠藥材飲片(北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司);鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-200208，含量測(cè)定用)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-200514，含量測(cè)定用)、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào):110732-200907，按鹽酸巴馬汀為86.1% 計(jì)，供含量測(cè)定用)、大黃素(批號(hào)756-9707)、大黃素甲醚(批號(hào)758-9301)、大黃酸(批號(hào)0757-200206)、大黃酚(批號(hào) 796-9303)、蘆薈大黃素(批號(hào) 795-9301)、熊果酸(批號(hào) 110742-200516)、漢黃芩素(1514-200202)、掌葉大黃對(duì)照藥材、黃連對(duì)照藥材、關(guān)黃柏對(duì)照藥材、黃芩對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;水為重蒸水;甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，硅藻土為化學(xué)純，其余試劑為分析純;濾膜(孔徑0.45 μm ，德國(guó) MEMBRANA 公司)。

1100系列高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、多波長(zhǎng)檢測(cè)器)，AJ150L電子精密天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，SK7210HP型KUDOS超聲波清洗機(jī)(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，SNB-2型數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(上海地學(xué)儀器研究所)，JC402PH/Mv智能式數(shù)字顯示酸度計(jì)(北京創(chuàng)業(yè)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為棕黃色稠厚液體。

2.2 鑒別

2.2.1 澤蘭的薄層色譜鑒別［3］157取本品5 g，加硅藻土5 g分散，晾干，加入乙醚30 mL，超聲10 min，濾過(guò);濾渣備用;濾液揮去溶劑，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。按處方配比稱(chēng)取除澤蘭以外的其它藥材，按芙蓉凝膠制備方法制備凝膠，并按供試品溶液的制備方法制備澤蘭陰性對(duì)照液。另取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同紫紅色斑點(diǎn);365 nm下顯相同橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 澤蘭的薄層色譜圖Fig.1 TLC of Herba Lycopi

2.2.2 大黃的薄層色譜鑒別［3］17供試品溶液制備同2.2.1項(xiàng);同2.2.1項(xiàng)中方法制備大黃陰性對(duì)照液。另取掌葉大黃對(duì)照藥材粉末0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚和大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液;再吸取上述對(duì)照品溶液各1 mL，混勻，作為對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL、對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠H板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同5個(gè)橙黃色熒光斑點(diǎn);置氨蒸氣熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 大黃的薄層色譜圖Fig.2 TLC of Radix et Rhizoma Rhei

2.2.3 黃連、關(guān)黃柏的薄層色譜鑒別［4］2.2.1項(xiàng)中乙醚提取后的濾渣揮盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)50 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。按處方配比稱(chēng)取除黃連、關(guān)黃柏藥材以外的其它藥材，按芙蓉凝膠制備方法制備凝膠，并按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。另取黃連對(duì)照藥材、關(guān)黃柏對(duì)照藥材各0.1 g，分別加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，作為對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取上述兩種對(duì)照品溶液等比例混合，作為混合對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，加入展開(kāi)箱一側(cè)槽中，另側(cè)槽加入與展開(kāi)劑等體積的濃氨試液共同預(yù)平衡20 min，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 黃連、關(guān)黃柏的薄層色譜圖Fig.3 TLC of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.2.4 黃芩的薄層色譜鑒別 供試品溶液制備同2.2.1項(xiàng)。同2.2.1項(xiàng)中方法制備黃芩陰性對(duì)照液。另取黃芩對(duì)照藥材0.1 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)4 mL，浸泡 1 h，超聲處理 30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，再取漢黃芩素對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL、對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，有相同的暗綠色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

圖4 黃芩的薄層色譜圖Fig.4 TLC of Radix Scutellariae

2.3 檢查

2.3.1 pH值 取本品1 g，稱(chēng)定，加蒸餾水10 mL使溶解，照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅦG pH值測(cè)定法試驗(yàn)，pH值為5.50～6.50。

2.3.2 黏度 照《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄ⅥG黏度測(cè)定法中第二法測(cè)定，動(dòng)力黏度為8 500～12 500 mPa·s。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺(25∶75∶0.2);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm(黃芩苷)，265 nm(鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿);柱溫:室溫;理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于2 500，按鹽酸巴馬汀計(jì)算不低于4 000，按鹽酸小檗堿計(jì)算不低于3 000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備及線(xiàn)性關(guān)系 精密稱(chēng)取已干燥(60℃減壓干燥4 h)的黃芩苷對(duì)照品0.012 6 g，用甲醇定容于10 mL量瓶中，制成濃度為1.26 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品貯備液;分別精密稱(chēng)取已干燥(100℃干燥5 h)的鹽酸巴馬汀對(duì)照品0.010 0 g、鹽酸小檗堿對(duì)照品0.013 0 g，用甲醇分別定容于25 mL量瓶中，分別制成濃度為0.344 4 mg/mL的鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液和0.52 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液。精密吸取上述黃芩苷對(duì)照品貯備液2 mL、鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液3 mL和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液5 mL于同一10 mL量瓶中，制成黃芩苷(0.252 mg/mL)、鹽酸巴馬汀(0.103 3 mg/mL)和鹽酸小檗堿(0.26 mg/mL)混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣 0.2、0.5、1、2、4 μL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄黃芩苷(276 nm)和鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿(265 nm)峰面積，分別以黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程分別為黃芩苷:Y=3 562.3X+10.646(r=0.999 7)，鹽酸巴馬汀:Y=4 114.3X+52.091(r=0.999 6)，鹽酸小檗堿:Y=4 607.6X-76.822(r=0.999 8)，表明黃芩苷在0.050 4～1.008 μg范圍、鹽酸巴馬汀在0.020 7～0.413 3 μg范圍、鹽酸小檗堿在0.052～1.04 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.5 HPLC of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin

2.4.3供試品溶液制備 取芙蓉凝膠約2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密稱(chēng)取等量硅藻土于同一錐形瓶中，將二者混合分散均勻;取混合物約0.4 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相10 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn):取凝膠的同一供試品溶液，每隔1 h左右進(jìn)樣測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6個(gè)小時(shí)，結(jié)果黃芩苷RSD=1.09%，鹽酸巴馬汀RSD=1.35%，鹽酸小檗堿RSD=1.40%，表明6 h內(nèi)黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿基本穩(wěn)定。

2.4.4.2 精密度試驗(yàn):同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.53%、0.42%和0.44%(n=5)，表明儀器精密度符合要求。

2.4.4.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn):按處方比例分別制備不含黃連、黃柏的凝膠和不含黃芩的凝膠，照2.4.3項(xiàng)方法制備黃連、黃柏和黃芩的陰性對(duì)照溶液，測(cè)定，結(jié)果顯示在與黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿保留時(shí)間相應(yīng)的位置上未見(jiàn)相關(guān)吸收峰，說(shuō)明本品中其他成分對(duì)黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖6，7。

圖6 黃芩陰性HPLC圖譜Fig.6 HPLC of blank of Radix Scutellariae

圖7 黃連、關(guān)黃柏陰性HPLC圖譜Fig.7 HPLC of blanks of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.4.4.4 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批芙蓉凝膠，共6份，按2.4.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果芙蓉凝膠中黃芩苷含量RSD=1.14%(n=6)，鹽酸巴馬汀含量RSD=1.37%(n=6)，鹽酸小檗堿含量 RSD=1.57%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。色譜圖見(jiàn)圖8。

圖8 芙蓉凝膠樣品HPLC圖譜Fig.8 HPLC of sample of Furong Gel

2.4.4.5 回收率試驗(yàn):精密吸取黃芩苷對(duì)照品貯備液4 mL、鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液4 mL和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液6 mL于同一25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得黃芩苷(0.201 6 mg/mL)、鹽酸巴馬汀(0.055 1 mg/mL)和鹽酸小檗堿(0.124 8 mg/mL)混合對(duì)照品溶液。取芙蓉凝膠約2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密稱(chēng)取等量硅藻土于同一錐形瓶中，將二者混合分散均勻;取混合物約0.2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相9.5 mL、混合對(duì)照品溶液0.5 mL，其余操作同2.4.3項(xiàng)供試品溶液的制備，按2.4.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率黃芩苷為101.49%，RSD為1.18%(n=6)，鹽酸巴馬汀為100.49%，RSD為0.87%(n=6)，鹽酸小檗堿為101.23%，RSD為1.42%(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test

2.4.5 樣品測(cè)定 取3批樣品，按供試品溶液制備方法制成供試液，精密吸取對(duì)照品溶液0.5 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芙蓉凝膠中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Contents of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin in Furong Gel

3 討論

3.1 曾經(jīng)針對(duì)芙蓉葉中的蘆丁等黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了薄層層析鑒別，但陰性對(duì)照有干擾，高效液相色譜也顯示陰性對(duì)照液中含有蘆丁，與澤蘭中含有蘆丁成分的文獻(xiàn)記載相符，故放棄。研究澤蘭薄層層析時(shí)以熊果酸和齊墩果酸作為陽(yáng)性對(duì)照，嘗試了多種供試液制備方法和展開(kāi)劑種類(lèi)，目前的條件干擾小、斑點(diǎn)清晰，但仍不能分離熊果酸和齊墩果酸，原因是二者為同分異構(gòu)體，化學(xué)性質(zhì)極其相近。鑒別黃芩時(shí)，嘗試了多種吸附劑和展開(kāi)劑，制劑中的基質(zhì)和其它成分總有干擾;現(xiàn)針對(duì)黃酮苷元成分進(jìn)行鑒別，采用現(xiàn)行展開(kāi)劑，可鑒別多種成分，斑點(diǎn)較為清晰。

3.2 含量測(cè)定時(shí)，分別對(duì)提取溶劑種類(lèi)及用量、提取方法及時(shí)間進(jìn)行了單因素考察，優(yōu)選出的條件對(duì)芙蓉凝膠中黃芩苷和鹽酸小檗堿的提取率高;HPLC分析時(shí)嘗試過(guò)多種流動(dòng)相，目前采用的流動(dòng)相分離度、對(duì)稱(chēng)性等符合要求，可同時(shí)測(cè)定芙蓉凝膠中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量。

［1］張志禮.中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:526.

［2］曾祖平，喬文越，劉 然，等.芙蓉凝膠的研制［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(19):15-18.

［3］中國(guó)藥典［S］.一部.2005.

［4］藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典中藥薄層色譜彩色圖集［M］.廣州:廣東科技出版社，1993:70-71.