人端粒酶催化亞單位(hTERT)反義分子探針的制備與理化性質初步研究

王榮福，劉 萌，張春麗，閆 平

北京大學第一醫院 核醫學科，北京 100034

反義顯像是將放射性核素標記的一段人工合成的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)引入體內后，根據“堿基互補配對原則”，追蹤其與病變組織中過度表達的目標DNA或mRNA發生特異性結合的過程，從而達到在基因水平上早期、特異、定量診斷疾病的目的[1-2]。大量研究證實，人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是迄今所知的人體腫瘤特異性最強的生物標志之一[3-4]，具有腫瘤特異診斷和治療的潛在應用價值。基于以上認識，本研究提出以hTERT為生物靶點，制備一種新型的反義分子探針，并對其理化性質進行初步研究。

選擇合適的放射性核素和適宜的標記方法是成功進行反義顯像的關鍵問題。在所應用的臨床顯像藥物中，放射性核素99Tcm及其標記的化合物約占總量的80%。99Tcm物理性能優良，為純γ光子發射體；能量適宜，為140 keV；半衰期(T1/2)合適，為6.02 h；獲取方便，可通過99Mo-99Tcm發生器產生；價格較為便宜；廣泛應用于臨床核醫學多種臟器的顯像診斷。因此，本研究擬選取放射性核素99Tcm標記針對hTERT mRNA的ASON，通過標記條件優化，制備反義分子探針。

1 實驗部分

1.1 主要試劑、材料及儀器

根據ASON的設計原則以及文獻報道[5]，針對hTERT mRNA的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)序列為5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′，正義寡核苷酸(sense oligonucleotide,SON)序列為5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′，每條鏈均為全硫代修飾，3′端連接一個伯氨結構，修飾結構式為5′-ASON-(CH2)6-NH2-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。雙功能螯合劑S-Acetyl NHS-MAG3由美國Hnatowich D J博士贈送。SephadexG25(Fine)，瑞典Amersham公司。SnCl2·2H2O，美國Sigma公司。99Tcm洗脫液，中國原子能科學研究院同位素研究所。

SMA3000-UV-VIS型微量分光光度計，北京華大基因研究中心。真空離心干燥儀，美國LABCONCO公司。RM905型放射性活度儀，中國計量科學研究院。FT-163型放射免疫測量儀，國營二六一廠。AlphaImagerTM2200凝膠成像儀，美國Alpha Innotech公司。

1.2 ASON與NHS-MAG3的偶聯反應

[6-7]報道，取5 OD ASON(OD即為吸光度值)，以HEPES緩沖液(0.1 mol/L，pH=8.0)溶解，質量濃度5 g/L。在振蕩條件下，將新鮮配制的NHS-MAG3溶液加入ASON溶液中，使二者的最終摩爾比(MAG3/ASON)達到20∶1。室溫下，靜置反應60～120 min。反應產物通過Sephadex G25層析柱(0.7 cm×28 cm)純化。洗脫液為PB緩沖液(50 mmol/L，pH=7.2)；洗脫產物按照每管0.4 mL收集。紫外分光光度計測定每管洗脫產物在260 nm處的波長吸收情況(OD260 nm)，計算產物含量(1 OD≈30 μg)。合并高峰管(OD260 nm值以及放射性活度值均最高的管)，以每管10 μg分裝。真空離心干燥后，-20 ℃條件下保存、備用。質譜分析MAG3-ASON，由北京大學醫學部醫藥衛生分析中心協助完成。

1.3 MAG3-ASON的放射性核素99Tcm標記

1.4 99Tcm-hTERT ASON的標記穩定性分析

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON溶液，分別放置在以下條件：① 原液(室溫)；② 加10倍體積的生理鹽水(37 ℃)；③ 加10倍體積的人新鮮血清(37 ℃)，孵育不同時間(0、1、2、4、6、8、24 h)后，分別取樣，紙層析法測定99Tcm-hTERT ASON的放射化學純度。

1.5 99Tcm-hTERT ASON的序列穩定性分析

取1 μg的99Tcm-hTERT ASON，溶于正常人新鮮血清中；在37 ℃條件下孵育不同時間(1、2、4、6 h)后，分別采用酚/氯仿法[8]從人新鮮血清中提取99Tcm-hTERT ASON；取樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)檢測。以未經血清37 ℃孵育的99Tcm-hTERT ASON作為對照組。

1.6 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白結合率

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON，與人新鮮血清(100 μL)在37 ℃水育箱中孵育不同時間(1、3、6 h)。其后采用酚/氯仿法沉淀血清蛋白，即：加入酚/氯仿溶液(體積比為1∶1)，充分混勻5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液；將沉淀物重復上述實驗1遍；分別收集上清液和沉淀物，γ放射免疫計數器計數(C)。根據公式計算：血清蛋白結合率=100%C沉淀物/(C上清液+C沉淀物)。

1.7 統計學分析

2 結果和討論

2.1 ASON與MAG3的偶聯反應結果

圖1 Sephadex G25凝膠層析結果Fig.1 Results of Sephadex G25 gel chromatographyA——MAG3-ASON， B——游離(Free)ASON

Sephadex G25凝膠層析可根據不同分子的分子量大小，有效分離偶聯和未偶聯的DNA以及未參與反應的雙功能螯合劑。層析產物通過紫外分光光度計測定OD260 nm值，其中高峰管A為偶聯產物(MAG3-ASON)，示于圖1。偶聯產物(MAG3-ASON)通過質譜分析，結果示于圖2。圖2(a)為ASON的質譜分析結果，顯示其相對分子質量為5 448.5；圖2(b)為MAG3-ASON的質譜分析結果，顯示其相對分子質量為5 796.5，與計算值相近。

99Tcm為金屬核素，其標記ASON最有效的方法就是在ASON末端加上一個合適的連接子，以使空間位阻最小化，然后通過連接子進行放射性核素標記。在ASON的3′端NH2與寡核苷酸骨架之間以己基(CH2)6作為連接子，有助于與螯合劑偶聯。此外，應用雙功能螯合劑還可避免由于放射性核素直接標記而導致的標記底物生物學活性的損傷[9]。S-Acetyl NHS-MAG3作為一種雙功能螯合劑，常用于99Tcm標記[6]。在ASON的5′或3′末端連接一伯胺結構；ASON通過伯胺與NHS-MAG3發生化學反應，形成穩定的酰胺鍵；在室溫和中性條件下，去除保護巰基的乙酰基基團；通過轉螯合作用，NHS-MAG3就能與99Tcm螯合，從而形成穩定的放射性標記物，結構示于圖3。

圖2 質譜分析結果Fig.2 Molecular mass of probe measured by MOLDI-TOF analysis(a)——ASON，Mr=5 448.5；(b)——MAG3-ASON，Mr=5 796.5

2.2 MAG3-ASON的99Tcm標記結果

利用放射性核素99Tcm標記MAG3-ASON，不同標記條件下標記產物的標記率示于圖4。

圖3 99Tcm-NHS-MAG3-ASON結構示意圖Fig.3 Structure of 99Tcm-NHS-MAG3-ASON

紙層析法測定標記產物的標記率與放射化學純度。放射性核素99Tcm標記MAG3-ASON的反應產物有3種成分：① 游離锝；② 水解锝；③ 絡合锝，即所需的標記產物99Tcm-hTERT ASON。前2種是放化雜質。3種99Tcm標記產物在展開體系中的比移值(Rf)列于表1。

圖4 不同SnCl2用量液體積(b)和反應時間(c)下標記產物的標記率Fig.4 Labeling efficiency of the product in different conditions: the mass of SnCl2 (a), the volume of (b), reaction time(c)

表和99TcmO2的Rf值Table 1 Rf of 99Tcm-hTERT ASON, and 99TcmO2

按上述反應條件，室溫下反應15～30 min后，99Tcm-hTERT ASON的標記率為76%±5%(n=5)；在相同條件下，無雙功能螯合劑作用，ASON的標記率僅為5.0%±1.6%(n=5)；二者比較有顯著差異(P<0.05)。99Tcm-hTERT ASON的放射化學純度可達96%以上，比活度為1 850 GBq/g。

圖5 Sephadex G25凝膠層析純化Fig.5 Results of Sephadex G25 gel chromatography

2.3 99Tcm-hTERT ASON的標記穩定性分析結果

將99Tcm-hTERT ASON放置在不同條件下(室溫、生理鹽水室溫孵育、正常人新鮮血清37 ℃孵育)，結果示于圖6。圖6結果表明，99Tcm-hTERT ASON在24 h內的放射性化學純度均大于93%。

圖6 不同條件下99Tcm-hTERT ASON在24 h內的放射化學純度Fig.6 Radiochemical purity of 99Tcm-hTERT ASON at different conditions during 24 h ◆——室溫(Room temperature)，●——生理鹽水室溫孵育(Incubation with normal saline at room temperature)，△——正常人新鮮血清37 ℃孵育(Incubation with fresh 37 ℃ human serum)

2.4 99Tcm-hTERT ASON的序列穩定性分析結果

體內應用時，不僅要保證99Tcm-hTERT ASON具有良好的放射穩定性，更要維持序列完整性，從而保證顯像所必須的序列特異性。PAGE凝膠電泳主要用于檢測小分子核酸的大小，或在同位素標記的情況下分析單鏈核酸，如分離寡核苷酸探針、S1核酸酶產物分析和DNA測序等。該方法適用于小分子DNA的分離(以5～500 bp最佳，其中bp表示堿基對)。對單鏈核酸來說，其分辨率可達1 bp。如果寡核苷酸發生降解，PAGE電泳結果上會出現異常條帶。從本研究的PAGE電泳結果來看(圖7)，僅在18 bp位置出現清晰的電泳條帶。這說明99Tcm-hTERT ASON在人新鮮血清中未發生任何降解，序列穩定性良好。

圖7 PAGE凝膠電泳分析Fig.7 PAGE Gel electrophoresisM——標準(Standard)DNA marker，1——對照組(未與血清孵育)(Control group without incubation)；與血清孵育組(Groups incubated with fresh 37 ℃ human serum )：2——1 h，3——2 h，4——4 h，5——6 h

2.5 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白結合率

將99Tcm-hTERT ASON放置在正常人新鮮血清(37 ℃)中孵育1、3、6 h后，其與血清蛋白的結合率分別為15.0%±1.6%、18.0%±1.9%、20.0%±2.4%。

在體內，一部分反義顯像劑會與血清蛋白結合，這使其進入靶組織的量減少，而血液中放射性長期處于一較高水平，引起靶/非靶組織(T/NT)的放射性比值下降，從而影響顯像質量。若反義顯像劑與血清蛋白結合率過高，還會對機體造成額外傷害，更會對寡核苷酸的生物學特性造成嚴重影響。然而，反義顯像劑與某些血清蛋白相互作用的消極意義從藥物動力學角度來看卻是有利的：其與血清蛋白的結合可使它的血清半衰期延長，且減慢腎臟排泄速度，有利于在腫瘤部位聚集。本研究結果顯示，99Tcm-hTERT ASON與血清蛋白結合率在6 h內約為20%。99Tcm-hTERT ASON與血清蛋白發生結合，可能與硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核酸(phosphorothioate oligonucleotides,PS)的硫原子修飾結構有關。因為PS的主要缺點之一就是在體內會與一些蛋白結合，特別是那些能和帶有多個負電荷分子相互作用的蛋白，這種非特異性結合的原因還不甚明了。

3 結 論

本課題選擇hTERT為靶點，設計、修飾與其特異性結合的ASON序列，通過雙功能螯合劑S-Acetyl NHS-MAG3進行放射性核素99Tcm標記。獲得的標記產物99Tcm-hTERT ASON具有較高的標記率、放射化學純度和比活度，且放射穩定性和序列穩定性良好，與血清蛋白具有一定的結合特性，適合作為反義顯像劑用于進一步的顯像研究[10-11]。

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